INLEDNING
Ibuprofen tillhör gruppen icke-steroida antiinflammatoriska läkemedel (NSAID) som används för att behandla olika inflammatoriska processer, smärta eller feber. Den mekanism som ligger till grund för ibuprofens effekter härrör från hämning av cyklooxygenas (COX)-aktiviteten, som krävs för prostaglandinsyntesen (PG).1 PG produceras från plasmamembranets arachidonsyra och lokal PG-produktion har hormonliknande effekter. Två COX-isoformer uttrycks i mänskliga vävnader: den konstitutivt uttryckta COX-1-isoformen finns i de flesta vävnader medan COX-2-isoformen är starkt inducerad under inflammatoriska reaktioner, inklusive patologiska tillstånd av kronisk inflammation och tjocktarmscancer.2 Bland olika COX-2-avledda produkter finns de högsta PGE2-nivåerna i tumörer och påverkar olika processer, inklusive cellproliferation och apoptos.3 I den normala fysiologin spelar PGE2 en roll i underhållet av den gastrointestinala slemhinnan och reglerar processer, såsom slemsekretion och utvidgning av blodkärl.4 Långvarig NSAID-behandling kan således leda till biverkningar, inklusive tarmblödning. De flesta NSAID, inklusive ibuprofen, hämmar båda COX-isoformerna.
Profylaktisk användning av NSAID har dokumenterats minska risken att dö i kolorektalcancer.5-9 Exempelvis visade en daglig dos aspirin på 300 mg under en tioårsperiod på en statistiskt signifikant skyddseffekt.7,10,11 En liknande riskreduktion har rapporterats med en daglig ibuprofendos på 200 mg8,11-19 för olika tumörtyper: Riskminskningen var 51 % för tjocktarmscancer, 72 % för bröstcancer, 62 % för prostatacancer och 59 % för lungcancer.19
Hur förebygger ibuprofen cancer?
Ackumulerade bevis har visat att inflammation främjar tumörigenesen,20,21 i synnerhet när vävnaden befinner sig under kroniska inflammatoriska förhållanden. I tumörens mikromiljö utbyter inflammatoriska celler signaler med tumörceller. Stromaceller utsöndrar överlevnadsfaktorer för tumörceller, medan tumörceller producerar cytokiner som utlöser stromacellernas proteolytiska ombyggnad av den extracellulära matrisen eller bildandet av nya blodkärl.20,22 Ibuprofen hämmar COX-aktiviteten och den efterföljande genereringen av proinflammatoriska PG; denna verkan tros ligga till grund för ibuprofens kemopreventiva effekt. PGE2 aktiverar till exempel G-proteinkopplade PGE2-receptorer som stimulerar olika signalvägar som är involverade i cellproliferation och överlevnad.23,24
I den här artikeln går författarna igenom ytterligare verkningsmekanismer som är oberoende av COX-2-hämning i syfte att öka medvetenheten om att de kliniska effekterna av ibuprofen kan medieras av flera cellulära processer. De presenterade bevisen hämtades från sökmotorn PubMed med ”ibuprofen AND cancer” som sökterm. Studier som rapporterade COX-oberoende effekter, inklusive de som utfördes i författarnas laboratorium, valdes ut för granskning.
ADDITIONELLA Mekanismer genom vilka ibuprofen hämmar tumörceller
2015 granskade Matos och Jordan25 behandlingen av cancerceller med ibuprofen. Kolorektalcellerna HCT-116 uttrycker inte COX-2, men behandling med 2 mMol/L ibuprofen gav proapoptotiska effekter.26 Ibuprofen i en låg koncentration på 100 µMol identifierades vidare som en direkt och COX-oberoende ligand för peroxisom proliferator-aktiverad receptor gamma (PPARγ),27 och visades stimulera dess nukleära aktivitet i råttmodeller av koloncancerbildning.28 Således kan den proapoptotiska verkan som observerats för ibuprofen delvis bero på PPARγ-aktivering, vilket leder till nedreglering av den antiapoptotiska transkriptionsfaktorn NFκB.28
En annan COX-oberoende cellulär reaktion efter ibuprofenbehandling rapporterades involvera P75NTR, en medlem av TNF-receptorns superfamilj. Behandling av cancerceller med 1 mMol/L ibuprofen resulterade i en p38 mitogenaktiverad proteinkinasvägsberoende stabilisering av p75NTR mRNA-stabiliteten, vilket ledde till ökade uttrycksnivåer29 och induktion av apoptos och tillväxtreduktion.30
En liknande apoptosfrämjande verkan rapporterades i HCT116-celler, då ibuprofenbehandling (1,5 mM i 24 timmar) visade sig göra dessa celler känsliga för den TNF-relaterade apoptosinducerande liganden.31 Den underliggande mekanismen involverade uttryck av membranreceptorn för TNF-relaterad apoptosinducerande ligand: dödsreceptor 5, en annan medlem av TNF-receptorns superfamilj.
Ibuprofenbehandling (1 mMol/L i 24 timmar) rapporterades vidare minska de nukleära nivåerna av β-catenin signifikant i SW480- och DLD-1-kolorektala tumörceller. Konsekvent undertrycktes uttrycket av ett av dess transkriptionella mål, den proproliferativa genen cyklin D1.32 Även om den underliggande mekanismen ännu inte är fastställd verkar denna effekt av ibuprofen vara av särskilt intresse för förebyggande av kolorektalcancer eftersom överdriven β-cateninsignalering kan leda till olämplig tillväxtstimulering av stamceller från kolonens slemhinna.33
Samtidigt med effekten på β-cateninsignalering interfererade ibuprofen också direkt med NFκB-signalvägen. En snabb effekt av ibuprofenbehandling som observerats i cellerna är den hämmande fosforyleringen av GSK-3β vid serin 9.32 Denna modifiering visade sig negativt reglera NFκB-signalering, i ett steg nedströms nedbrytningen av dess inhibitorprotein IkBα, och undertrycka uttrycket av antiapoptotiska NFκB-målgener, såsom BCL2 och BIRC5.
Andra exempel på COX-oberoende effekter av 100 µMol ibuprofen inkluderar hämning av integrinuttryck i neutrofiler34 eller caspasmedierad frisättning av proinflammatoriska cytokiner i HCT-116- och HeLa-celler.35
IBUPROFEN, ALTERNATIE SPLICING OCH CANCER
Cancerceller skiljer sig i sitt genuttrycksprogram från motsvarande differentierade normala celler. Förutom transkriptionell reglering vid genpromotorer har de senaste 15 åren tydligt visat att alternativ splicing fungerar som en viktig mekanism för reglering av genuttryck. Till exempel genererar alternativ splicing transkriptvarianter som antingen kan vara icke-funktionella och snabbt nedbrytas eller översättas till proteinisoformer med olika, ibland antagonistiska, funktionella egenskaper på grund av olika användning av funktionella proteindomäner.36,37
Nyligen identifierades hämning av den alternativa splicingvarianten RAC1b som en annan COX-oberoende effekt av ibuprofen.38 Koloninflammation visades vara en utlösande faktor för ökat uttryck av det tumörrelaterade RAC1b-proteinet, en splicingvariant av det lilla GTPaset RAC1. RAC1b-proteinet innehåller en ytterligare domän som kodas av ett 57 baspar långt alternativt exon (exon 3b), som ger ökad proteinaktivering, vilket genererar en hyperaktiv variant som kan stimulera NFκB-signalering39-42 . När kolorektala celler behandlades med ibuprofen, men inte med aspirin eller flurbiprofen, minskade både mRNA- och proteinnivåerna av RAC1b markant in vitro och in vivo.38 Medan många studier om effekten av NSAID på tumörcellers livskraft använde sig av koncentrationer på upp till 2 mMol/L,43 observerades effekten av ibuprofen på alternativ splicing av RAC1b vid låga doser på 100 µMol. Intressant nog hämmade ibuprofen RAC1b-positiva HT29-kolorektalceller mer än normala kolonocyter och påverkade också deras tillväxt som subkutana tumör xenografts i möss. Den hämmande effekten av ibuprofen kunde räddas när en splicingoberoende RAC1b cDNA-sekvens uttrycktes i HT29-cellen.38 Detta tyder på att ibuprofen verkar direkt på den alternativa splicinghändelsen.
En annan rapport om modulering av alternativ splicing erhölls när prostatacancerceller fick kombinerad behandling av ibuprofen och epigallocatechin-3-gallat (EGCG), en komponent från grönt te med antikarcinogena egenskaper som främjar G0/G1-cellcykelstopp och apoptos. I detta fall försköts balansen mellan anti och proapoptotiska splicingvarianter av BCL-X och MCL-1 mot de kortare och proapoptotiska BCL-X(S)- eller MCL-1(S)-varianterna44. Även om mekanismen inte var helt identifierad, involverar den aktivering av proteinfosfatas PP1, som är känt för att defosforylera regulatoriska proteiner som är involverade i pre-mRNA-splicing.
Mekanism för SPLICING MODULERING AV IBUPROFEN
När proteinkodande gener uttrycks i mänskliga celler genererar RNA-polymeras 2 ett primärt transkript, pre-mRNA, som innehåller kodande exoner som är separerade av introniska sekvenser. Medan transkriptionen pågår känns konserverade nukleotidsekvenser runt varje exon-intron-övergång igen av spliceosomen, ett makromolekylärt maskineri som omfattar fem små nukleära ribonukleoproteinpartiklar (U1, U2, U4, U5 och U6 små nukleära ribonukleoproteiner),45,46 som sedan avlägsnar intronerna under processen för mRNA-splicing. Spliceosomens funktion stöds av splice enhancer- eller silencerelement, korta sekvenser som finns i exoner eller introner och som antingen främjar eller hämmar spliceosomens produktiva erkännande av ett visst exon. Splicingfaktorer känner igen dessa splice enhancer- eller silencerelement, som för det mesta tillhör den serin- och argininrika proteinfamiljen eller de heterogena nukleära ribonukleoproteinerna. De agerar ofta antagonistiskt, så att moduleringen av bindningen ger en mekanism som gör det möjligt att inkludera eller hoppa över en alternativ exon och därmed generera alternativa transkript. Sammantaget fungerar den uppsättning splicingfaktorer som uttrycks i en viss cell och deras relativa uttrycksnivåer i cellkärnan på ett kombinatoriskt sätt för att reglera alternativ splicing.
För RAC1b regleras den alternativa skarvningen av ett enhancerelement i exon 3b, som känns igen av skarvningsfaktorn SRSF1, och ett intilliggande silencerelement som känns igen av SRSF3.47
I humana kolorektala celler är tillgängligheten av SRSF1 i cellkärnan den viktigaste faktorn för att reglera inkludering eller överhoppning av exon 3b.48
En mekanism genom vilken ibuprofen påverkar alternativ splicing i celler är fosforyleringsstatusen för SRSF1. Cellfraktionering och immunoblot-experiment visade att ibuprofenbehandling orsakade en minskning av SRSF1-fosforylering (opublicerade data). Däremot hade aspirinbehandling ingen sådan effekt på SRSF1. Detta visade att den hämmande effekten av ibuprofen på RAC1b-splicing involverade posttranslationell reglering av SRSF1:s subcellulära lokalisering.48
Det huvudsakliga proteinkinas som ansvarar för SRSF1-fosforylering är SRPK1, som finns både i cytoplasman och i cellkärnan.49,50 Denna process styrs delvis av signalering från tillväxtfaktorreceptorer.51 Som visas och beskrivs i figur 1 observerade författarna att ibuprofenbehandling inducerade translokation av SRPK1 från cellkärnan till cytoplasman, och detta korrelerade med minskade nivåer av SRSF1-fosforylering och RAC1b-protein som detekterades i helcellslysat med western blot. Ingen sådan effekt observerades när cellerna behandlades med aspirin under samma förhållanden, vilket understryker ibuprofens COX-oberoende verkan och specificiteten hos dess effekt på modulering av splicingfaktorer.