Bortom Michaelis-Menten-ekvationen: Scientific Reports

Två typer av modeller som beskriver enzymkinetik: Det fria enzymet (E) binder reversibelt till substratet (S) för att bilda komplexet (C), och komplexet dissocieras irreversibelt till produkten (P) och det fria enzymet:

$$E+S\underset{{k}_{b}}{\overset{{k}_{f}}{\rightleftharpoons }}C\mathop{\to }\limits^{{k}_{cat}}E+P,$$

där den totala enzymkoncentrationen (E T ≡ C + E) och den totala substrat- och produktkoncentrationen (S T ≡ S + C + P) är bevarade. En populär modell som beskriver ackumulationen av produkten över tiden bygger på MM-ekvationen enligt följande (se Supplementary Method för detaljerad härledning):

där K M = (k b + k cat )/k f är Michaelis-Menten-konstanten och k cat är den katalytiska konstanten. Denna sQ-modell som härletts med den vanliga QSSA-modellen har använts i stor utsträckning för att uppskatta de kinetiska parametrarna K M och k cat från produktens utvecklingskurva8,9,10,11,23,25. En annan modell som beskriver ackumulationen av produkten härrör från den totala QSSA-modellen; den utvecklades senare än sQ-modellen och har därför fått mindre uppmärksamhet för parameteruppskattning26,27,28,29:

Och även om denna tQ-modell är mer komplicerad än sQ-modellen är den exakt över större områden än sQ-modellen. Specifikt är sQ-modellen korrekt när

vilket kräver en låg enzymkoncentration7,14. Å andra sidan är tQ-modellen korrekt när

där K = k b /k f är dissociationskonstanten27,28,29. Det är viktigt att detta villkor är allmänt giltigt och därför är tQ-modellen, till skillnad från sQ-modellen, korrekt även när enzymet är i överskott. Se14,30 för mer information.

Därefter undersökte vi noggrannheten hos de stokastiska simuleringar som utfördes med båda modellerna. Specifikt jämförde vi de stokastiska simuleringarna med hjälp av Gillespie-algoritmen baserad på propensitetsfunktionerna från antingen den ursprungliga fullständiga modellen (beskriven i tabell S1), sQ-modellen (tabell S2) eller tQ-modellen (tabell S3) för 9 olika förhållanden31,32,33,34,35,36: E T är antingen lägre än, liknar eller är högre än K M , och S T är också antingen lägre än, liknar eller är högre än K M (fig. 1). De stokastiska simuleringarna av sQ-modellen kan inte approximera simuleringarna av den ursprungliga fullständiga modellen när E T inte är låg (dvs. när E T inte är lägre än varken S T eller K M ). Å andra sidan är de stokastiska simuleringarna med hjälp av tQ-modellen korrekta under alla förhållanden (fig. 1), vilket stämmer överens med en nyligen genomförd studie som visar att stokastiska simuleringar med sQ- och tQ-modellerna är korrekta när deras deterministiska giltighetsvillkor är uppfyllda (Eq. (3) och (4))37,38. Sammantaget är tQ-modellen giltig för ett större antal förhållanden än vad sQ-modellen är i både deterministisk och stokastisk mening.

Där sQ-modellen misslyckas med att närma sig den ursprungliga fullständiga modellen när E T ökar, är tQ-modellen korrekt oberoende av E T . Stokastiska simuleringar av den ursprungliga fullständiga modellen (tabell S1), sQ-modellen (tabell S2) och tQ-modellen (tabell S3) utfördes med S T = 0,2, 2 eller 80 nM och E T = 0,2, 2 eller 40 nM. Observera att dessa koncentrationer är antingen lägre än, liknande eller högre än K M ≈ 2 nM. Här representerar linjerna och de färgade områdena en genomsnittlig bana och ett fluktuationsområde (±2σ från genomsnittet) av 104 stokastiska simuleringar.

Skattning med tQ-modellen är opåverkad för alla kombinationer av enzym- och substratkoncentrationer

Då tQ-modellen är noggrann för ett bredare spektrum av förhållanden än vad sQ-modellen är (Fig. 1), ställde vi hypotesen att parameterskattningen som baseras på tQ-modellen också är noggrann för mer allmänna förhållanden. För att undersöka denna hypotes genererade vi först 102 bullriga framstegskurvor för P från de stokastiska simuleringarna av den ursprungliga fullständiga modellen (Fig. S1). Därefter härledde vi parametrar (k cat och K M ) från dessa simulerade datamängder genom att tillämpa Bayesiansk inferens med sannolikhetsfunktionerna baserade på antingen sQ- eller tQ-modellen, under svagt informativa gammaprioriteter (Fig. S2) (se Metoder för detaljer). Observera att vi i hela den här studien har använt de simulerade produktutvecklingskurvorna (t.ex. Fig. S1) eftersom vi måste känna till parametrarnas sanna värden för att kunna göra en noggrann jämförelse av skattningarna baserade på sQ-modellen och tQ-modellen.

Vi fokuserade först på skattningen av k kat under antagandet att värdet av K M är känt. När E T är låg, så att både sQ- och tQ-modellen är korrekta (fig. 1 till vänster), är de efterföljande urvalen som erhålls med båda modellerna likartade och fångar framgångsrikt det sanna värdet av k cat (fig. 2a till vänster). De efterföljande prover som erhålls med de två modellerna är likartade eftersom, när E T är låg och därmed \({E}_{T}\ll {S}_{T}+{K}_{M}\), båda modellerna (Eq. 1 och 2) är ungefär likvärdiga enligt följande:

där den första approximationen kommer från Taylor-expansionen i termer av \({E}_{T}({S}_{T}-P)/({E}_{T}+{K}_{M}+{S}_{T}-P)\ll 1\) (se27,28,29 för detaljer). När \({E}_{T}\ll {S}_{T}+{K}_{M}\) och därmed sQ-modellen är korrekt bör därför uppskattningarna med sQ- och tQ-modellerna vara likartade. Å andra sidan, när E T är hög, visar de tydliga skillnader (fig. 2a höger): de efterföljande urvalen som erhålls med sQ-modellen visar stora fel, medan de som erhålls med tQ-modellen exakt fångar det sanna värdet av k cat .

Skattningen av en enskild parameter (k cat eller K M ) med antingen sQ- eller tQ-modellen. För varje tillstånd (S T = 0,2, 2 eller 80 nM och E T = 0,2, 2 eller 40 nM) erhölls 105 posteriorprover av antingen k cat (a) eller K M (b) genom att tillämpa den bayesianska inferensen på 102 bullriga datamängder (fig. S1) (se Metoder för detaljer). När k cat provtas är K M fixerad till sitt sanna värde (a) och vice versa (b). Här anger gröna trianglar parametrarnas sanna värden. Medan de skattningar av k cat och K M som erhålls med sQ-modellen är snedvridna när E T ökar, har de skattningar som erhålls med tQ-modellen försumbar snedvridning oberoende av förhållandena (se fig. S3 för boxplottar av skattningarna). När E T eller S T ökar ökar den efterföljande variansen för K M när tQ-modellen används.

Samma resultat observeras också i boxplottarna för efterföljande medelvärden och efterföljande variationskoefficienter (CV) (Fig. S3a,b). Medan efterföljande medelvärden som erhålls med sQ-modellen är snedvridna när E T är hög, är de medelvärden som erhålls med tQ-modellen korrekta för alla förhållanden (fig. S3a). Särskilt de snäva fördelningarna av efterföljande medelvärden tyder på att uppskattningen av k cat med tQ-modellen är robust mot bruset i data (Fig. S1). Dessutom är de efterföljande CV:erna mycket mindre än de tidigare CV:erna (fig. S3b), vilket tyder på en exakt uppskattning av k cat med tQ-modellen.

Nästan skattades K M under antagandet att värdet av k cat är känt (fig. 2b). Posteriorprover av K M som erhålls med sQ-modellen visar återigen fel som ökar med ökande E T . Observera att skattningarna av K M är snedvridna uppåt, vilket innebär att det kan vara missvisande att använda de efterföljande skattningarna av K M för att validera MM-ekvationen (\({K}_{M}\gg {E}_{T}\)). Å andra sidan är de skattningar av K M som erhålls med tQ-modellen lite snedvridna för alla förhållanden. Till skillnad från de smala posteriora fördelningarna av k cat (fig. 2a) blir dock de av K M som erhålls med tQ-modellen bredare, så precisionen minskar när E T eller S T ökar (fig. 2b). Dessa mönster observeras också i boxdiagrammen för efterföljande medelvärden och efterföljande CV:er (fig. S3c,d). Identifierbarhetsproblemet uppstår eftersom, när \({E}_{T}\gg {K}_{M}\) eller \({S}_{T}\gg {K}_{M}\) och därmed \({E}_{T}+{S}_{T}\gg {K}_{M}\), K M är försumbar i tQ-modellen (Eq. 2), enligt följande:

Specifikt när K M är för låg har värdet på K M liten effekt på dynamiken i tQ-modellen och därmed är K M strukturellt oidentifierbar. Sammantaget är uppskattningarna av K M med både sQ- och tQ-modellen inte tillfredsställande, om än av olika skäl: uppskattningarna med sQ-modellen kan vara snedvridna och de med tQ-modellen kan vara strukturellt oidentifierbara (fig. 2b). Liknande mönster observerades också när en mer informativ prior gavs (fig. S4). I synnerhet, även med den informativa prioriteten visar skattningar som erhållits med sQ-modellen fortfarande betydande fel när E T ökar.

Simultan skattning av k cat och K M lider av bristen på identifierbarhet

Nästan betraktade vi samtidig skattning av två parametrar, k cat och K M , vilket är det typiska målet inom enzymkinetiken. För samma gammaprioriteter som användes vid skattningen av en enda parameter (fig. 2) blev fördelningarna av de efterföljande proverna som erhölls med båda modellerna överlag bredare (fig. 3). För att hitta orsaken till denna oprecisa uppskattning analyserade vi spridningsdiagrammen för efterföljande k cat- och K M-prover (fig. 4). När \({S}_{T}\ll {K}_{M}\) (Fig. 4a-c) uppvisade de efterföljande proverna av k cat och K M som erhållits med sQ-modellen en stark korrelation, eftersom dynamiken i sQ-modellen endast beror på förhållandet k cat /K M , vilket framgår av följande approximation:

där \({K}_{M}\gg {S}_{T}\ge {S}_{T}-P\) används. Å andra sidan, när \({S}_{T}\gg {K}_{M}\) (Fig. 4g-i), blir spridningsdiagrammet för sQ-modellen horisontellt, vilket tyder på att strukturen är oidentifierbar för K M . Värdet på K M har faktiskt nästan ingen effekt på dynamiken hos sQ-modellen, vilket framgår av följande approximation:

där K M + S T ≈ S T används som \({S}_{T}\gg {K}_{M}\). En sådan brist på parameteridentifierbarhet när \({S}_{T}\ll {K}_{M}\) eller \({S}_{T}\gg {K}_{M}\) överensstämmer med tidigare studier, som rekommenderar att man använder S T ≈ K M för en mer exakt uppskattning22,23. Även när S T ≈ K M är uppskattningarna dock fortfarande oprecisa (fig. 3a och b mitten). När E T ökar är dessutom de skattningar som erhålls med sQ-modellen snedvridna (fig. 3), precis som i skattningen med en enda parameter (fig. 2). Baserat på denna analys verkar det som om den samtidiga skattningen av k cat och K M med sQ-modellen är en utmaning på grund av både identifierbarhetsproblem och problem med bias.

Simultan skattning av två parametrar (k cat och K M ) med antingen sQ- eller tQ-modellen. Från samma 102 datamängder (fig. S1) som användes i skattningen av en enda parameter (fig. 2) erhölls 105 efterföljande urval av k cat (a) och K M (b) tillsammans. Även om samma prioritet ges blir de efterföljande fördelningarna bredare än vid uppskattningen med en enda parameter (fig. 2). Här anger gröna trianglar de sanna värdena för k cat eller K M .

Spridningsdiagrammen för de efterföljande proverna som erhållits med tvåparameterskattningen (fig. 3). Spridningsdiagrammen antyder två typer av oidentifierbarhet av strukturer: stark korrelation mellan k cat och K M , och oidentifierbarhet av K M , som representeras som en horisontell diagram. Positivt korrelerade spridningsdiagram för tQ-modellen ändras till horisontella diagram när den samplade K M är mycket lägre än S T + E T (streckade grå linjer). Här representerar gröna trianglar parametrarnas sanna värden.

När \({E}_{T}\gg {K}_{M}\) eller \({S}_{T}\gg {K}_{M}\) har K M en försumbar effekt på tQ-modellens dynamik (Eq. 6), och därmed kunde endast k cat identifieras i estimeringen av en enskild parameter (Fig. 2a och b till höger och ner). På samma sätt, när både k cat och K M härleds samtidigt med tQ-modellen, är uppskattningen av endast k cat korrekt och exakt (fig. 3a och b höger eller nederst), vilket framgår av de horisontella spridningsdiagrammen längs det sanna värdet av k cat (fig. 4c,f,g-i). I andra fall (när varken \({E}_{T}\gg {K}_{M}\) eller \({S}_{T}\gg {K}_{M}\)) ökar den efterföljande variansen för båda parametrarna dramatiskt jämfört med skattningen med en enda parameter (fig. 2 och 3 till vänster och uppåt). En sådan oprecis uppskattning härrör från två källor, enligt spridningsdiagrammen (fig. 4a,b,d,e). När k cat och K M minskar tillsammans ändras tQ-modellens beteende föga som SQ-modellen (Eq. 5), vilket leder till den starka korrelationen mellan de efterföljande proverna av k cat och K M . När skattningarna av K M fortsätter att minska tillsammans med skattningarna av k cat , så att de blir mycket mindre än E T + S T (streckad vertikal linje i fig. 4), beror tQ-modellen inte längre på värdet av K M , enligt Eq. 6, och därmed blir spridningsdiagrammen horisontella.

Kombinerade data från olika experiment möjliggör en korrekt och exakt uppskattning med tQ-modellen

Som visats ovan lider uppskattningen av både k cat och K M med hjälp av en enda förloppskurva av betydande bias och bristande identifierbarhet (fig. 3 och 4), vilket stämmer överens med tidigare studier som rapporterar att en förloppskurva som erhållits från ett enda experiment inte är tillräcklig för att identifiera båda parametrarna samtidigt19. Därför undersöker vi här om man kan förbättra uppskattningen genom att använda flera datauppsättningar för tidsförlopp som erhållits under olika experimentella förhållanden.

I typiska in vitro-analyser mäts utvecklingskurvorna med antingen en fast S T och varierad E T eller en fast E T och varierad S T 8,9,10,11,39. Vi tar först hänsyn till det fall då framstegskurvorna mäts med en fast S T och en varierad E T . Specifikt används framstegskurvor från både låg och hög E T för att skatta parametrar för en fast S T på olika nivåer (fig. S1 överst och nederst). I det här fallet visar de efterföljande prover som erhålls med sQ-modellen avsevärda fel när data från hög E T används (fig. 5a och S5). Å andra sidan fångar de efterföljande prover som erhålls med tQ-modellen noggrant de sanna värdena för både k cat och K M med låg varians (fig. 5a och S5). En sådan förbättring beror på att data som erhållits under låg och hög E T ger olika typer av information för parameteruppskattning. Särskilt från data med hög E T, även om K M inte kan identifieras, kan k cat uppskattas noggrant med tQ-modellen (fig. 4c,f,i). En sådan noggrann uppskattning av k cat från data med hög E T kan förhindra korrelationen mellan k cat och K M när de uppskattas från data med låg E T (fig. 4a, d). De smala spridningsdiagrammen för tQ-modellen (fig. 5b till vänster och i mitten) är faktiskt skärningspunkterna mellan två spridningsdiagram, ett horisontellt diagram som erhållits med hög E T-data (fig. 4c,f) och ett icke-horisontellt diagram som erhållits med låg E T-data (fig. 4a,d). När S T är hög blir dock spridningsdiagrammet från den låga E T också horisontellt (fig. 4c), och därmed minskar den synergistiska effekten av att använda kombinerade data (fig. 5a,b höger). Sammantaget kan tQ-modellen korrekt skatta båda parametrarna från kombinationen av data med låg E T och hög E T när S T inte är mycket större än K M . Observera att en sådan låg S T är att föredra för in vitro-experiment24,39,40,41 och är fallet för de flesta fysiologiska förhållanden24.

När data som erhållits under låg E T och hög E T används tillsammans ökar noggrannheten och precisionen för skattningar som erhållits med tQ-modellen, men inte med sQ-modellen. (a) Posterior samples infereras med hjälp av dataset från E T = 0,2 nM (Fig. S1 överst) och E T = 40 nM (Fig. S1 nederst) tillsammans för antingen S T = 0,2, 2 eller 80 nM. Den efterföljande variansen för tQ-modellen minskar dramatiskt till nivån för skattningen med en enda parameter (fig. 2). Skattningarna av sQ-modellen uppvisar dock betydande bias. Här representerar gröna trianglar de sanna värdena för k cat eller K M . (b) Spridningsdiagrammen för de efterföljande urvalen. Här representerar gröna trianglar, blå cirklar och röda fyrkanter sanna värden, efterföljande medelvärden för sQ-modellen respektive de för tQ-modellen.

Nästan betraktar vi fallet när framstegskurvorna mäts med en fast E T och en varierad S T . Specifikt används kombinationen av två framstegskurvor från låg och hög S T för att härleda parametrar för en fast E T på olika nivåer (fig. S1 vänster och höger). När E T är låg, och sQ- och tQ-modellerna därmed beter sig på samma sätt (Eq. 5), fångar de efterföljande prover som erhålls med båda modellerna exakt de sanna värdena för k cat och K M (fig. 6a vänster och S6). Återigen erhålls det smala spridningsdiagrammet (fig. 6b vänster) som skärningspunkten mellan ett icke-horisontellt spridningsdiagram för låg S T (fig. 4a) och ett horisontellt spridningsdiagram för hög S T (fig. 4g). När E T ökar, och därmed sQ-modellen blir mindre exakt, är dock de som erhålls med sQ-modellen snedvridna, som förväntat (fig. 6a höger och S6). Medan sådana snedvridningar inte observeras i de som erhålls med tQ-modellen, minskar precisionen i K M-skattningarna när E T ökar, precis som vid skattningen med en enda parameter (fig. 2 och ekv. 6).

Skattning med hjälp av data som erhållits under låg S T och hög S T tillsammans. (a) Posterior samples infereras med hjälp av dataset från S T = 0,2 nM (fig. S1 vänster) och S T = 80 nM (fig. S1 höger) tillsammans för antingen E T = 0,2, 2 eller 40 nM. När E T är låg möjliggör både sQ- och tQ-modellen en korrekt och exakt uppskattning. När E T ökar blir de uppskattningar som erhålls med sQ-modellen oprecisa och de uppskattningar av K M som erhålls med tQ-modellen blir mindre exakta, på samma sätt som vid uppskattning med en enda parameter (fig. 2). Här representerar gröna trianglar de verkliga värdena för k cat eller K M . (b) Spridningsdiagrammen för de efterföljande urvalen. Här representerar gröna trianglar, blå cirklar och röda fyrkanter sanna värden, sQ-modellens efterföljande medelvärden respektive tQ-modellens medelvärden.

Optimal utformning av experiment för noggrann och effektiv estimering med tQ-modellen

När en framstegskurva som erhållits från ett enda experiment används kan de efterföljande spridningsdiagrammen för tQ-modellen kategoriseras som en korrelerad typ (fig. 4a,b,d,e) och en horisontell typ (fig. 4c,f,g-i). Skärningspunkterna mellan dessa två olika typer av spridningsdiagram tenderar att vara snävt fördelade nära det sanna värdet (figurerna 5b och 6b). Genom att kombinera två sådana datamängder kan man alltså göra en noggrann uppskattning av både k cat och K M (fig. 5a och 6a). En utvecklingskurva mätt under \({E}_{T}\ll {K}_{M}\) och \({S}_{T}\ll {K}_{M}\) (fig. 4a,b,d,e) och en mätt under \({E}_{T}\gg {K}_{M}\) eller \({S}_{T}\gg {K}_{M}\) (fig. 4a,b,d,e). 4c,f,g-i) ger olika typer av information för parameteruppskattning; därför leder användning av båda datamängderna till en lyckad uppskattning. Det är dock svårt att jämföra värdena för S T , E T och K M i praktiken, eftersom värdet för K M vanligtvis är okänt i förväg. Detta problem kan enkelt lösas genom att använda spridningsdiagrammet. Det vill säga, om den efterföljande spridningsdiagrammet som erhålls från det första experimentet är horisontellt, bör både E T och S T minskas för nästa experiment, så att ett icke horisontellt spridningsdiagram kan erhållas (fig. 7a). Om spridningsdiagrammet från det första försöket däremot visar en stark korrelation mellan K M och k cat , bör antingen S T eller E T ökas i nästa försök (fig. 7b). Utan någon förhandsinformation om värdet av K M och k cat bestämmer formen på spridningsdiagrammen för de aktuella uppskattningarna i princip nästa optimala experimentella utformning, vilket garanterar en korrekt och exakt uppskattning. Detta tillvägagångssätt kan dock inte användas med sQ-modellen, eftersom uppskattningen med sQ-modellen kan vara snedvriden beroende på förhållandet mellan E T eller S T och K M , som är okänt i förväg. Det vill säga, till skillnad från tQ-modellen garanterar exakt skattning inte alltid korrekt skattning med sQ-modellen, vilket framgår ovan (t.ex. figur 5a till höger).

Den optimala försöksutformningen för korrekt och exakt skattning med tQ-modellen. (a) När spridningsdiagrammet för efterföljande prover från det första experimentet är horisontellt måste E T och S T minskas för att få ett icke-horisontellt spridningsdiagram i nästa experiment. Att använda kombinationen av de två experimenten leder då till en korrekt och exakt uppskattning (röda spridningsdiagram). (b) När spridningsdiagrammet från det första experimentet inte är horisontellt måste E T eller S T ökas i nästa experiment för att få ett horisontellt spridningsdiagram. (c) Slutsats med en enda framstegskurva från den låga E T (0,1 K M ) och den höga E T (10 K M ) leder till icke-horisontella respektive horisontella spridningsdiagram för chymotrypsin, ureas och fumaras (grå spridningsdiagram). När båda datamängderna användes tillsammans erhölls korrekta uppskattningar för alla enzymer (röda spridningsdiagram). Här används låg S T (0,1 K M ). Här representerar gröna trianglar parametrarnas sanna värden.

Vi testar om det föreslagna tillvägagångssättet med tQ-modellen kan ge en korrekt uppskattning av k cat och K M för katalys av N-acetylglycinetylester, fumarat och urea av enzymerna chymotrypsin, ureas respektive fumaras (fig. 7c). Dessa tre enzymer valdes ut eftersom de har olika katalytisk effektivitet (k cat /K M )1: 0,12, 4 – 105 respektive 1,6 – 108 s -1 M -1. För varje enzym genererades 102 stökiga tidsförloppsdataserier med hjälp av stokastiska simuleringar baserade på kända enzymkinetiska parametrar1. När framstegskurvor som erhållits med låg E T och låg S T används, som förväntat, erhölls icke-horisontella spridningsdiagram av efterföljande prover för alla tre enzymerna (fig. 7c). Detta tyder på att antingen E T eller S T bör ökas i nästa experiment för att få en horisontell spridningsdiagram. När en utvecklingskurva med en 100-faldig ökning av E T användes erhölls horisontella spridningsdiagram för alla enzymer (fig. 7c). När dessa två kurvor används tillsammans kan därför både k cat och K M uppskattas korrekt (fig. 7c, röda prickar). Dessa resultat stöder att en sådan optimerad försöksplanering i två steg (fig. 7a, b) för att få två olika typer av scatter plots möjliggör en exakt och effektiv uppskattning av enzymkinetiken med tQ-modellen. Det beräkningspaket som utför en sådan uppskattning tillhandahålls (se Metod för detaljer).