Inhoud en eigenschappen van intracellulaire vloeistof

Dit hoofdstuk is vaag relevant voor Sectie E(iv) van de 2017 CICM Primary Syllabus, die van de examenkandidaat verwacht dat hij “de samenstelling …van intracellulaire vloeistof beschrijft”. Omdat dit de sectie over cellulaire fysiologie is, zal de focus hier vooral liggen op het microniveau van organisatie, en zal alle bespreking van het intracellulaire lichaamsvloeistofcompartiment worden overgelaten aan de sectie Lichaamsvloeistoffen.

Het feit dat de college-examinatoren hun oog nooit op dit onderwerp hebben laten vallen, verleent aan de bespreking ervan een bijna bevrijdende sfeer van zinloosheid, omdat zowel de examenkandidaten als de auteur zich er aangenaam van bewust zijn dat de een de ander zijn tijd verdoet. In plaats van zich te verdiepen in harde wetenschap en hier examenfeiten uit het hoofd te leren, kan men gemakkelijk verder lezen om zuiver medutainment redenen, of verder gaan met onderwerpen die meer punten opleveren.

In samenvatting:

Wat zijn de geldige peer-reviewed bronnen voor dit onderwerp? Helaas zijn die talrijk. Wanneer men een zoekmachine of de indexsectie van een leerboek gebruikt om “intracellulaire vloeistof” op te zoeken, komt er onvermijdelijk een antwoord, een reeks vermeldingen of pagina’s of powerpointdia’s die – hoewel ze qua inhoud allemaal vaag op elkaar lijken – verschillen in hun geciteerde waarden, en niets bieden op het vlak van referenties. Vele bieden geen enkele nuttige informatie. In de officiële collegeboeken over dit onderwerp (Ganong, blz. 2 van de 23e druk, en Guyton & Hall, blz. 4 van de 13e druk) worden cytosolische elektrolytconcentraties besproken met termen als “grote hoeveelheden”. Zelfs buiten de officiële bibliografie hebben anders solide boeken als Molecular Biology of the Cell geen duidelijke antwoorden. Ze kunnen het er zelfs niet over eens worden hoe het genoemd moet worden (cytosol? Protoplasma? Primordialschlauch?)

Gelukkig zijn er nog steeds wetenschappers die over dit onderwerp publiceren. Het beste artikel is waarschijnlijk dat van Katherine Luby-Phelps uit 1999, dat in principe alles bevat wat je nodig zou kunnen hebben om alle hypothetische toekomstige SAQ’s over dit onderwerp te beantwoorden. Een ander uitstekend artikel dat hoofdzakelijk handelt over de eigenschappen van het intracellulaire materiaal is het korte artikel van Richard P. Sear (2005). Als men echt gek is en de tijd heeft van een specialist met een vast contract (d.w.z. geen dringende verplichting om daadwerkelijk nuttig werk te verrichten), kan men in plaats daarvan Gilbert Ling’s In Search of the Physical Basis of Life (1984) bestuderen, een boek van 800 bladzijden van de hand van een man wiens publicaties over celfysiologie tot in de jaren vijftig reiken.

Volume van een intracellulaire ruimte

Hoe groot is een cel? Dat hangt natuurlijk van de cel af. Een goed voorbeeld van een uitschieter is de Xenopus oöcyt, het ei van een Afrikaanse klauwpad dat 1 mm in doorsnee is. Wanneer men het over de mens heeft, spreekt men gewoonlijk over intracellulaire vloeistof alsof het een betrekkelijk homogene emmer is, maar in feite bestaat dat vloeistofcompartiment uit zo’n 1014 minuscule compartimenten die elk een iets ander volume en een iets andere samenstelling hebben.

De heterogeniteit van al deze volumes is goed samengevat in dit hoofdstuk van de BioNumbers database, waar allerlei minutieus gerefereerde informatie is te vinden. Het wordt hier met minimale aanpassingen gereproduceerd, voor het geval de Harvard servers ooit crashen.

Volumes van zoogdiercellen

Cellentype	Volume (μm3, of femtoliter)	Volume (picoliter)	Referentie
Spermacel	30	0.03	Gilmore et al, 1995
Erythrocyt	100	0.1	Ballas et al, 1987
Lymfocyt	130	0.13	Schmid-Schonbein et al, 1980
Neutrofiel	300	0.3	Rosengren et al, 1994
Pancreatische β-cel	1,000	1.0	Finegood et al, 1995
Enterocyte	1,400	1,4	Wiśniewski et al, 2012
Fibroblast	2,000	2.0	Mitsui et al, 1976
Cervicale tumor (HeLa)	3,000	3.0	Zhao et al, 2008
Haarcel (oor)	4,000	4.0	Géléoc et al, 1999
Osteoblast	4,000	4,0	Beck et al, 2011
Alveolaire macrofaag	5,000	5,0	Beck et al, 2011
Alveolaire macrofaag	5,000	5.0	Krombach et al, 1997
Cardiomyocyte	15,000	15,0	Calvillo et al, 2003
Megacaryocyte	30,000	30.0	Harker et al, 2000
Adipocyte	60,000	60.0	Livingston et al, 1984
Oocyte	4,000,000	4000	Goyanes et al, 1990

Dus, het is een vrij breed gamma. Bovendien zal uiteraard niet de gehele inhoud van de cel worden ingenomen door “intracellulaire vloeistof”, ongeacht wat uw definitie van die term is. In het kader van dit hoofdstuk zal de definitie van intracellulaire vloeistof bijvoorbeeld zijn “intracellulaire inhoud die geen organellen zijn”, louter omdat organellen in een ander hoofdstuk worden besproken. Waar we het in dat geval over hebben, is de “grijsachtige, viskeuze, slijmerige, halfdoorzichtige en halfvloeibare substantie” die de intracellulaire ruimte tussen andere structuren inneemt (Harvey, 1937).

Afhankelijk van het soort cel dat je bekijkt, kan die ruimte een zeer klein deel van het totale volume zijn. Bij voorbeeld, in de omentale adipocyt met abovel zal van die 60 picoliter totaal volume, het overgrote deel worden ingenomen door waterloos vet. Dit kan experimenteel worden aangetoond: DiGirolamo & Owens (1976) konden berekenen dat het watervolume in rattenadipocyten ongeveer 5-7% van het totale volume bedroeg, d.w.z. 1,5-2 picoliter.

Kortom, we kijken naar een zeer klein volume. Waarom is dat van belang? Wel. Het interne vloeibare volume van 1-2 picoliter van de cel is het distributievolume voor oplosbare stoffen. De moleculen van die stoffen moeten dus een zeer korte afstand afleggen voordat zij elkaar tegenkomen. Dit heeft tot gevolg dat de reactiesnelheid toeneemt, hetgeen nuttig is omdat de totale hoeveelheid reagensmoleculen voor zo’n klein volume noodzakelijkerwijs klein is. Om een voorbeeld van Luby-Phelps (2000) te lenen: als een cel een totale inhoud van 1 nanomole van een eiwit heeft, betekent dit dat er slechts 1000 kopieën van dat eiwit in de cel aanwezig zijn. Gelukkig kan een bindingsmolecuul met zo’n klein te doorkruisen volume, zelfs met een lage affiniteit, het grootste deel van het beschikbare substraat opzuigen en adsorberen.

Eiwitinhoud van de intracellulaire vloeistof

Ok, het volume is dus klein. Welke macromoleculen zitten erin, en met hoeveel zijn ze? Alice B. Fulton (1982) gaf hierop waarschijnlijk het meest duidelijke antwoord in de gepubliceerde literatuur. In principe ligt het eiwitgehalte van cellen tussen 17 en 35% van het gewicht, waarbij de meeste auteurs ergens in de buurt van 20-30g/100ml komen. Fulton citeert oude teksten (Loewy et al, 1969) om de volgende waarden te geven:

• Spiercellen: 23% eiwit per gewicht
• Erytrocyten: 35% eiwit per gewicht
• De meeste andere cellen: 17% tot 26% eiwit per gewicht

De metingen worden meestal gedaan door brekingsindexmetingen, wat een techniek is die gewoonlijk geen onderscheid maakt tussen structurele eiwitten (b.v. die waaruit het cytoskelet en de organellen zijn opgebouwd) en oplosbare eiwitten waaruit de rest van de smurrie bestaat.

Dus, wat is het nut van deze discussie? Nou. Deze concentratie van eiwitten is vrij hoog. Het ligt boven de gewoonlijk aanvaarde concentratie van grote polymeren waarvan zou worden verwacht dat zij de diffusie van andere soortgelijke polymeren zou beïnvloeden, m.a.w. het bos is te dicht. Chang et al. (1987) hebben een wiskundig model opgesteld dat voorspelt dat voor polymeren van 50kDa en meer, die diffusielimiet ongeveer 130g/L is, d.w.z. bij meer dan dat zullen andere polymeren niet gemakkelijk door de oplossing kunnen diffunderen. Zeker, zij gebruikten polystyreen opgelost in benzeen, maar het blijft een feit. Ter vergelijking: wanneer men een eiwit volledig kristalliseert, krijgt men een “vaste stof” die slechts voor 40% uit eiwit bestaat

Samengevat: de eiwitten in de intracellulaire vloeistof zitten zo dicht opeengepakt dat het cytosol moet worden omschreven als een “overvolle oplossing”. Het cartooneske diagram hier (oorspronkelijk gepubliceerd door Goodsell in 1993, en vervolgens gereproduceerd door vrijwel iedereen die ooit over het cytosol heeft geschreven) laat visueel precies zien hoe dicht die lichamen opeengepakt zijn. De tekening werd benaderd, met behulp van bekende maten en vormen van moleculen / elektronenmicroscoop, maar foto’s genomen door de SEM (bijv. door Bridgman & Reese, 1984) tonen aan dat het correct de rommelige microstructuur van het cytosol weergeeft. Kijkend naar Xenopus oocyten bij een vergroting van ~ 80.000, wordt een dicht woud van filamenten en korrels zichtbaar. De foto hier (een deel van hun figuur 6) was eigenlijk schoongemaakt een beetje door cel lysis en detergent wassen, om een deel van het eiwit lading die anders verduisterd de fijnere structuur te verwijderen. De pijlen wijzen naar de Y- en T-verbindingen van de filamenten.

Zonder het wassen met detergent wordt al het fijne korrelige materiaal tussen deze filamenten zichtbaar. Het beeld lijkt nu op witte ruis (zelfde auteurs).

Het is duidelijk dat diffusie door dit struikgewas niet normaal zal zijn. Kleinere opgeloste deeltjes (bijv. uw natrium- en kaliumionen) moeten om deze enorme obstakels heen navigeren en de toeristische route naar elkaar toe nemen. Praktisch gezien zou dit moeten betekenen dat elke reactie die afhankelijk is van de diffusiesnelheid, trager zal verlopen. Als moleculen er een eeuwigheid over doen om elkaar te bereiken, dan zou de netto snelheid van hun interactie zeker moeten afnemen. We zien dit echter niet.

Welke chemische eigenschappen zien we, bij deze sterk verzadigde eiwitachtige soep? Allen P. Minton (2006) heeft jaren van (voornamelijk eigen) onderzoek samengevat in een tabel van het hierboven aangehaalde artikel. Het is hier samengevat:

• Verhoogde bindingsaffiniteit van anders verdunde macromoleculen voor elkaar
• Versnelling van eiwitassociaties bv. zelfassemblage
• Vertraging van diffusie-beperkte reacties en eiwitassociaties
• Stabilisatie van eiwitten tegen thermische denaturatie

Samenvattend dwingt crowding eiwitten tot vouwen en interactie, wat complexe configuraties oplevert die anders in een verdunde oplossing onmogelijk zouden zijn. Zo ontdekte Wilf & Minton in 1981 dat verdunde myoglobinemoleculen in oplossing weinig belangstelling voor elkaar hebben, maar dat de toevoeging van een 10%-oplossing van (om het even welk!) ander eiwit het myoglobine spontaan doet samenklonteren tot dimeren.

Eigenschappen van intracellulair water

Zelfs in een gekristalliseerd eiwit bestaat slechts 40% van de massa uit echt eiwit. De rest is oplosmiddel dat de ruimte tussen opeengepakte eiwitmoleculen inneemt (ze zijn niet precies rechthoekig en stapelen niet netjes op elkaar). Wanneer het oplosmiddel water is, wordt de helft ervan geadsorbeerd aan het eiwitoppervlak, maar de rest kan nog steeds worden gezien als gewoon vloeibaar water. In deze dunne film zijn de ionen van het intracellulaire water opgelost.

Met het gebonden geadsorbeerde water liggen de zaken duidelijk iets anders. Zo zullen de solventeigenschappen van dit water niet precies dezelfde zijn als die van “vrij” water. Ten eerste zal het waarschijnlijk een verminderde chemische activiteit hebben. Zoals te verwachten geeft de “geordende” toestand van water het een aantal ongebruikelijke colligatieve eigenschappen – Foster et al. (1976) vonden bijvoorbeeld dat het vriespunt verlaagd is. Bovendien zullen er zones van cytosol zijn met verhoogde activiteit (rond hydrofiele eiwitstructuren) en verlaagde activiteit (rond de hydrofobe).

Hoeveel van het water wordt door de eiwitten in deze gevangen toestand gehouden? Dat is enigszins moeilijk te zeggen. Experimenten van Ling e.a. (1993) suggereren dat binnen cellen het meeste water op deze manier “geordend” is, maar de meeste experimenten die hierover rapporteren worden enigszins beïnvloed door het feit dat de ruwe levende cellen die zij gebruiken verschillende homeostatische reacties op de experimentele omstandigheden hebben die de bevindingen in de war sturen.

In het algemeen probeert men dit antwoord vast te stellen door cellen osmotisch uit te drogen. Als je een osmotische druk uitoefent, zo redeneren zij, zou al het “mobiele” water uit de cel moeten komen. Vervolgens meet je het watergehalte van de cel, en alles wat overblijft moet “immobiel” zijn, geparkeerd op het oppervlak van eiwitmoleculen en niet in staat om te migreren als reactie op de osmotische druk. Cameron et al. (1997) presenteren de grafiek (schaamteloos gestolen en hier links weergegeven) waarin het watergehalte van de overblijvende cellen wordt uitgezet tegen een x-as van toenemende osmotische druk. De lijn van druk versus overblijvend water, geëxtrapoleerd uit experimenteel bewijs en doorgetrokken naar een “oneindige” osmotische druk, kruist uiteindelijk de y-as op een niet-nul punt. Afhankelijk van de cellen die je gebruikte, eindigde dat ergens tussen 30-90% van het totale watergehalte.

Het lijkt er zelfs op dat dit water, geadsorbeerd aan eiwitten, het essentiële water in de cellen is, en al het “vrije” water is zinloze ballast. Clegg (1981), die gedroogde cellen van pekelkreeftjes rehydrateerde, ontdekte dat de metabolische activiteit werd hervat en relatief normaal was wanneer de cellen werden hersteld met ongeveer 35% water per gewicht. d.w.z. ongeveer zoveel als wordt verwacht om alle macromoleculen te “hydrateren”. In die garnalen was er vrijwel zeker geen vrij water in de “bulkfase” aanwezig. Zeker, ze probeerden zich niet voort te planten of RNA te synthetiseren (dat vereist hydratatie tot 70-80%), maar hun synthese van aminozuren en gasuitwisseling verliep relatief normaal. Des te opmerkelijker is het feit dat bij objectieve meting deze dikke 20-30% proteïnesoep een viscositeit heeft die sterk lijkt op die van normaal water (Luby-Phelps, 1994)

Intracellulaire vloeistof pH

Carter (1972) publiceerde hierover een zeer invloedrijk artikel, dat vaak wordt geciteerd in leerboeken over menselijke fysiologie, ook al gebruikte de auteur spieren van de reuzenzeepok (Balanus nubilus) die hij ophing in iets dat “barnacle Ringer’s solution” wordt genoemd, een pekel met 450 mmol/L natrium en 518 mmol/L chloride erin. Men kan nauwelijks verder lezen met enig respect voor de menselijke generaliseerbaarheid van dergelijke gegevens, maar als men dat doet zou men de belangrijkste bevinding ontdekken: dat de pH in cellen zo gecompartimenteerd is dat verschillende regio’s van het cytosol wild verschillende pH-waarden hadden, in een bereik van 6,0 tot 7,5.

Intracellulaire elektrolytenconcentraties

In het algemeen zullen alle leerboeken, wanneer gevraagd wordt naar de concentratie van elektrolyten in de intracellulaire vloeistof, een Gamblegram als dit opleveren (ontleend aan Ling, 1984, zonder toestemming van zijn nalatenschap of zijn uitgever).

Dit diagram hier wordt niet genoemd in het boek van Ling, maar men zou kunnen aanvoeren dat dat ook niet hoeft, aangezien Ling vrijwel al het baanbrekende werk heeft verricht om het gedrag van intracellulaire opgeloste stoffen te bepalen. Meer bepaald hebben hij en Ochsenfeld in de jaren zestig vastgesteld dat dit kalium (en alle andere elektrolyten in het cytosol) over het algemeen niet aanwezig is in een vrij beschikbare vorm, maar in plaats daarvan wordt geadsorbeerd aan de macromoleculaire structuren.

De onderzoekers daagden cellen uit met radioactief gemerkte isotopen en ontdekten dat dit weinig effect had op de verplaatsing van de elektrolyten die daar al aanwezig waren, wat te verwachten zou zijn als ze vrij verspreid zouden zijn. De intracellulaire elektrolyten zijn grotendeels aanwezig in complexen met macromoleculen en zijn veel minder mobiel dan men zou verwachten van een celmodel waarin alle inhoud in een homogene waterige zak bestaat. Dezelfde auteurs (Ling & Ochsenfeld, 1973) bevestigden later dat de mobiliteit van kalium van het intracellulaire naar het extracellulaire compartiment ongeveer een achtste was van wat verwacht zou kunnen worden van eenvoudige diffusie in vrije oplossing. Uit dode kikkerspieren lekte kalium iets gemakkelijker weg (de diffusiesnelheid was slechts 25% lager dan verwacht), omdat door ATP aangedreven pompen niet meer werkten en de eiwitstructuur gedesorganiseerd raakte.

Dus, laten we het eens zijn dat deze ionen niet opgelost zijn in een klotsend meer van vrij intracellulair water, maar eerder gebonden zijn in complexen. Dat is nog steeds geen antwoord op de vraag: hoeveel van wat zit er in? Blijkbaar is dat relatief eenvoudig te beantwoorden. Veel eenvoudiger, in feite, dan alle andere vragen die tot nu toe in dit hoofdstuk aan de orde zijn gesteld. Men hoeft alleen maar zijn cytosol te nemen, het te vriesdrogen, en dan de elementaire samenstelling van de droge massa te meten. Mason et al. (1981) deden precies dit voor enkele renale tubulaire cellen, voor en na het letsel. Hun bevindingen zijn hieronder weergegeven, zowel in de vorm van de oorspronkelijke tabel uit 1981 als in een mooi glanzend Gamblegram:

Zoals men kan zien aan de wilde schommelingen van de kaliumconcentratie na zelfs maar 20 minuten ischemie, is de elektrolytsamenstelling van cellen veel vloeibaarder dan die van de extracellulaire vloeistof (waar een verandering van 20 mmol in de concentratie van om het even welke elektrolyt slecht zou worden getolereerd, op een soort existentieel overlevingsniveau van het organisme). Daar komt nog bij dat elke cellijn een iets andere intracellulaire ionconcentratie zal hebben. Dit leidt tot de onnauwkeurigheid van de intracellulaire elektrolytwaarden die in leerboeken worden besproken, en tot hun algemene terughoudendheid om getallen te noemen. Vrijwel elk getal dat je noemt zal fout zijn. Mason’s distale tubuli hadden bijvoorbeeld 11mmol/L natrium in hun cytosol, maar Poole-Wilson (1975) vond ongeveer 44mmol/L in linker ventriculaire myocyten en 20mmol/L in de linker quadriceps. Alam e.a. (1977) geven waarden van ongeveer 25 mmol/L voor natrium en 145 mmol/L voor kalium in sommige levercellen in moeilijkheden. Kortom, de rommelige en onvoorspelbare omgeving van een gegeven cel maakt het moeilijk om specifieke getallen te noemen.