INTRODUZIONE
L’ibuprofene appartiene al gruppo dei farmaci antinfiammatori non steroidei (FANS) usati per trattare diversi processi infiammatori, dolore o febbre. Il meccanismo alla base degli effetti dell’ibuprofene deriva dall’inibizione dell’attività della cicloossigenasi (COX), che è necessaria per la sintesi delle prostaglandine (PG).1 Le PG sono prodotte dall’acido arachidonico derivato dalla membrana plasmatica e la produzione locale di PG ha effetti simili agli ormoni. Due isoforme COX sono espresse nei tessuti umani: l’isoforma COX-1 costitutivamente espressa esiste nella maggior parte dei tessuti mentre l’isoforma COX-2 è fortemente indotta durante la risposta infiammatoria, comprese le condizioni patologiche di infiammazione cronica e il cancro al colon.2 Tra i diversi prodotti derivati dalla COX-2, i più alti livelli di PGE2 si trovano nei tumori e influenzano vari processi, tra cui la proliferazione cellulare e l’apoptosi.3 Nella fisiologia normale, la PGE2 svolge un ruolo nel mantenimento della mucosa gastrointestinale, regolando processi come la secrezione di muco e la dilatazione dei vasi sanguigni.4 Pertanto, un trattamento prolungato con FANS può portare a effetti collaterali, tra cui il sanguinamento intestinale. La maggior parte dei FANS, compreso l’ibuprofene, inibisce entrambe le isoforme COX.
È stato documentato che l’uso profilattico dei FANS riduce il rischio di morire per il cancro colorettale.5-9 Per esempio, una dose giornaliera di 300 mg di aspirina per un periodo di 10 anni ha rivelato un effetto protettivo statisticamente significativo.7,10,11 Una riduzione del rischio simile è stata riportata con una dose giornaliera di ibuprofene di 200 mg8,11-19 per vari tipi di tumore: 51% di riduzione del rischio per il colon, 72% per il seno, 62% per la prostata e 59% per il cancro ai polmoni.19
Come fa l’ibuprofene a prevenire il cancro?
L’accumulo di prove ha rivelato che l’infiammazione promuove la tumorigenesi,20,21 in particolare quando il tessuto è in condizioni infiammatorie croniche. All’interno del microambiente tumorale, le cellule infiammatorie scambiano segnali con le cellule tumorali. Le cellule stromali secernono fattori di sopravvivenza per le cellule tumorali, mentre le cellule tumorali producono citochine, che innescano il rimodellamento proteolitico della matrice extracellulare da parte delle cellule stromali, o la formazione di nuovi vasi sanguigni.20,22 L’ibuprofene inibisce l’attività della COX e la conseguente generazione di PG proinfiammatorie; questa azione si pensa sia alla base dell’effetto chemiopreventivo dell’ibuprofene. La PGE2, per esempio, attiva i recettori PGE2 accoppiati alla proteina G che stimolano varie vie di segnalazione coinvolte nella proliferazione e sopravvivenza cellulare.23,24
In questo articolo, gli autori passano in rassegna ulteriori meccanismi d’azione indipendenti dall’inibizione della COX-2 allo scopo di aumentare la consapevolezza che gli effetti clinici dell’ibuprofene possono essere mediati da diversi processi cellulari. Le prove presentate sono state recuperate dal motore di ricerca PubMed usando “ibuprofene E cancro” come termine di ricerca. Gli studi che riportano effetti COX-indipendenti, compresi quelli condotti nel laboratorio degli autori, sono stati selezionati per la revisione.
MECCANISMI AGGIUNTIVI ATTRAVERSO I QUALI IBUPROFENE INIBISCE LE CELLULE TUMORALI
Nel 2015, Matos e Jordan25 hanno esaminato il trattamento delle cellule tumorali con ibuprofene. Le cellule colorettali HCT-116 non esprimono COX-2, ma il trattamento con 2 mMol/L di ibuprofene ha prodotto effetti proapoptotici.26 L’ibuprofene a una bassa concentrazione di 100 µMol è stato ulteriormente identificato come un ligando diretto e indipendente dalla COX del recettore gamma attivato dal proliferatore del perossisoma (PPARγ),27 e ha dimostrato di stimolare la sua attività nucleare in modelli di ratto di formazione del cancro al colon.28 Pertanto, l’azione proapoptotica osservata per l’ibuprofene può in parte derivare dall’attivazione del PPARγ, che porta alla downregulation del fattore di trascrizione antiapoptotico NFκB.28
Un’altra risposta cellulare indipendente dalla COX dopo il trattamento con ibuprofene è stata riportata per coinvolgere P75NTR, un membro della superfamiglia dei recettori TNF. Il trattamento delle cellule tumorali con 1 mMol/L di ibuprofene ha provocato una stabilizzazione dipendente dalla via della proteina chinasi attivata da mitogeno p38 della stabilità dell’mRNA p75NTR, con conseguente aumento dei livelli di espressione29 e induzione di apoptosi e soppressione della crescita.30
Un’azione simile di promozione dell’apoptosi è stata riportata nelle cellule HCT116, quando il trattamento con ibuprofene (1,5 mM per 24 ore) è risultato sensibilizzare queste cellule contro il ligando induttore dell’apoptosi legato al TNF.31 Il meccanismo sottostante ha coinvolto l’espressione del recettore di membrana per il ligando induttore di apoptosi legato al TNF: il recettore della morte 5, un altro membro della superfamiglia dei recettori del TNF.
Il trattamento con ibuprofene (1 mMol/L per 24 ore) è stato inoltre riportato per ridurre significativamente i livelli nucleari di β-catenina nelle cellule tumorali colorettali SW480 e DLD-1. Coerentemente, l’espressione di uno dei suoi bersagli trascrizionali, il gene pro-proliferativo della ciclina D1, è stato soppresso.32 Anche se il meccanismo sottostante deve ancora essere determinato, questo effetto dell’ibuprofene sembra di particolare interesse per la prevenzione del cancro colorettale perché un’eccessiva segnalazione di β-catenina può causare una stimolazione inappropriata della crescita delle cellule staminali della mucosa del colon.33
Concorrente all’effetto sulla segnalazione di β-catenina, l’ibuprofene ha anche interferito direttamente con la via di NFκB. Un rapido effetto del trattamento con ibuprofene osservato nelle cellule è la fosforilazione inibitoria di GSK-3β alla serina 9.32 Questa modifica è stata trovata per regolare negativamente la segnalazione di NFκB, in una fase a valle della degradazione della sua proteina inibitrice IkBα, e per sopprimere l’espressione dei geni target anti-apoptotici di NFκB, come BCL2 e BIRC5.
Altri esempi di effetti COX-indipendenti di 100 µMol di ibuprofene includono l’inibizione dell’espressione dell’integrina nei neutrofili34 o il rilascio mediato dalla caspasi di citochine proinfiammatorie nelle cellule HCT-116 e HeLa.35
IBUPROFEN, ALTERNATIE SPLICING E CANCRO
Le cellule tumorali differiscono nel loro programma di espressione genica dalle corrispondenti cellule normali differenziate. Oltre alla regolazione trascrizionale ai promotori dei geni, gli ultimi 15 anni hanno chiaramente rivelato che lo splicing alternativo serve come un meccanismo significativo per la regolazione dell’espressione genica. Per esempio, lo splicing alternativo genera varianti di trascrizione che possono essere non funzionali e rapidamente degradate o essere tradotte in isoforme proteiche con proprietà funzionali diverse, a volte antagoniste, a causa dell’uso differenziale di domini proteici funzionali.36,37
Recentemente, l’inibizione della variante alternativa di splicing RAC1b è stata identificata come un altro effetto COX-indipendente dell’ibuprofene.38 L’infiammazione del colon è stata dimostrata come un fattore scatenante l’aumento dell’espressione della proteina RAC1b legata al tumore, una variante di splicing della piccola GTPasi RAC1. La proteina RAC1b contiene un dominio aggiuntivo codificato da un esone alternativo lungo 57 paia di basi (esone 3b), che conferisce una maggiore attivazione della proteina, generando una variante iperattiva in grado di stimolare la segnalazione di NFκB.39-42 Quando le cellule del colon-retto sono state trattate con ibuprofene, ma non con aspirina o flurbiprofene, sia i livelli di mRNA che di proteina di RAC1b sono stati marcatamente ridotti in vitro e in vivo.38 Mentre molti studi sull’effetto dei FANS sulla vitalità delle cellule tumorali hanno utilizzato concentrazioni fino a 2 mMol/L,43 l’effetto dell’ibuprofene sullo splicing alternativo di RAC1b è stato osservato a basse dosi di 100 µMol. È interessante notare che l’ibuprofene ha inibito le cellule colorettali HT29 RAC1b-positive più dei colonociti normali e ha anche influenzato la loro crescita come xenotrapianti tumorali sottocutanei nei topi. L’effetto inibitorio dell’ibuprofene poteva essere salvato quando una sequenza di cDNA RAC1b indipendente dallo splicing veniva espressa nelle cellule HT29.38 Questo suggerisce che l’ibuprofene agisce direttamente sull’evento di splicing alternativo.
Un altro rapporto sulla modulazione dello splicing alternativo è stato ottenuto quando le cellule di cancro alla prostata hanno ricevuto un trattamento combinato di ibuprofene ed epigallocatechina-3-gallato (EGCG), un componente del tè verde con proprietà anticancerogene che promuove l’arresto del ciclo cellulare G0/G1 e l’apoptosi. In questo caso, l’equilibrio tra le varianti di splicing anti e proapoptotiche di BCL-X e MCL-1 è stato spostato verso le varianti BCL-X(S) o MCL-1(S) più corte e proapoptotiche.44 Sebbene il meccanismo non sia stato completamente identificato, esso coinvolge l’attivazione della proteina fosfatasi PP1, che è nota per defosforilare le proteine regolatrici coinvolte nello splicing del pre-mRNA.
MECCANISMO DELLA MODULAZIONE DELLO SPLICING DA PARTE DI IBUPROFEN
Quando i geni codificanti le proteine sono espressi nelle cellule umane, la RNA polimerasi 2 genera un trascritto primario, il pre-mRNA, che contiene esoni codificanti separati da sequenze introniche. Mentre la trascrizione è in corso, le sequenze nucleotidiche conservate intorno ad ogni giunzione esone-introne sono riconosciute dallo spliceosoma, un macchinario macromolecolare che coinvolge cinque piccole particelle di ribonucleoproteine nucleari (U1, U2, U4, U5 e U6),45,46 che poi rimuove gli introni durante il processo di splicing dell’mRNA. La funzione dello spliceosoma è assistita da elementi splice enhancer o silencer, brevi sequenze presenti negli esoni o negli introni, che promuovono o inibiscono il riconoscimento produttivo di un determinato esone da parte dello spliceosoma. I fattori di splicing riconoscono questi elementi splice enhancer o silencer, che per lo più appartengono alla famiglia delle proteine ricche di serina e arginina o alle ribonucleoproteine nucleari eterogenee. Spesso agiscono in modo antagonista, in modo che la modulazione del legame fornisce un meccanismo che permette l’inclusione o il salto di esoni alternativi e quindi la generazione di trascrizioni varianti. Nel complesso, l’insieme dei fattori di splicing espressi in una data cellula e i loro livelli di espressione relativa nel nucleo della cellula operano in modo combinatorio per regolare lo splicing alternativo.
Nel caso di RAC1b, lo splicing alternativo è regolato da un elemento enhancer nell’esone 3b, riconosciuto dal fattore di splicing SRSF1, e da un elemento silenziatore adiacente riconosciuto da SRSF3.47
Nelle cellule colorettali umane, la disponibilità di SRSF1 nel nucleo è il principale fattore che regola l’inclusione o il salto dell’esone 3b.48
Un meccanismo attraverso il quale l’ibuprofene influenza lo splicing alternativo nelle cellule è lo stato di fosforilazione di SRSF1. Il frazionamento cellulare e gli esperimenti di immunoblot hanno rivelato che il trattamento con ibuprofene ha causato una riduzione della fosforilazione di SRSF1 (dati non pubblicati). Al contrario, il trattamento con aspirina non ha avuto questo effetto su SRSF1. Questo ha dimostrato che l’effetto inibitorio dell’ibuprofene sullo splicing RAC1b coinvolge la regolazione post-traslazionale della localizzazione subcellulare di SRSF1.48
La principale proteina chinasi responsabile della fosforilazione di SRSF1 è SRPK1, che si trova sia nel citoplasma che nel nucleo delle cellule.49,50 Questo processo è, in parte, controllato dalla segnalazione del recettore del fattore di crescita.51 Come mostrato e descritto nella Figura 1, gli autori hanno osservato che il trattamento con ibuprofene ha indotto la traslocazione di SRPK1 dal nucleo al citoplasma, e questo è correlato a livelli ridotti di fosforilazione di SRSF1 e della proteina RAC1b come rilevato nei lisati di cellule intere tramite western blot. Nessun effetto simile è stato osservato quando le cellule sono state trattate con aspirina nelle stesse condizioni, sottolineando l’azione COX-indipendente di ibuprofene e la specificità del suo effetto sulla modulazione del fattore di splicing.