Tecniche di anticorpi fluorescenti

Di Benedette Cuffari, M.Sc.Reviewed by Emily Henderson, B.Sc.

Dalla sua scoperta originale nel 1942, la colorazione in immunofluorescenza è rimasta una tecnica altamente affidabile e potente per una vasta gamma di ricerche e scopi diagnostici.

Cellule leucemiche etichettate con molecole fluorescenti. Image Credit: Vshivkova/.com

In generale, le tecniche di fluorescenza degli anticorpi (FA) implicano l’uso di cellule o di un anticorpo, la cui regione costante è stata marcata con un’etichetta fluorescente, altrimenti nota come fluoroforo. Le tecniche di FA sono spesso classificate come dirette o indirette.

Anticorpo a fluorescenza diretta

La tecnica dell’anticorpo a fluorescenza diretta, che può essere altrimenti indicata come immunofluorescenza diretta (DIF), comporta l’uso di un singolo anticorpo primario marcato con fluorescenza che viene utilizzato per legarsi a un antigene bersaglio. Quando viene usata clinicamente, la DIF è particolarmente utile per la diagnosi rapida di malattie batteriche come lo Streptococcus pyogenes, che è più comunemente noto come streptococco, così come la polmonite che è il risultato delle specie Mycoplasma pneumoniae e Legionella pneumophilia.

Per tali scopi diagnostici, il campione del paziente viene prima posto su un vetrino da microscopio e poi esposto all’anticorpo fluorescente. Qualsiasi legame tra l’anticorpo marcato con la fluorescenza e l’antigene bersaglio, che per queste situazioni sarebbero i batteri, farà sì che queste sostanze si illuminino all’esame con un microscopio a fluorescenza.

Oltre al suo uso come strumento diagnostico, la DIF è anche ampiamente utilizzata per studi di ricerca scientifica. Per tali scopi, un campione di tessuto congelato che è stato tagliato in sezioni sottili di 5 o 6 micrometri (µm) viene posto su un vetrino di vetro.

I vetrini vengono poi incubati con un anticorpo con tag fluorescente, che in genere include un pannello di anticorpi che sono diretti contro gli isotipi anticorpali IgA, IgG e IgM insieme al complemento 3, che è mirato contro l’antigene di interesse.

Nota che la concentrazione dell’anticorpo utilizzato per questo tipo di studio sarà basato su esperimenti precedenti che hanno confermato quale concentrazione può raggiungere il più alto rapporto segnale-fondo.

Dopo che i vetrini sono stati incubati per almeno 30 minuti al buio e a temperatura ambiente, i vetrini vengono lavati e poi ripresi con un microscopio a fluorescenza.

Image Credit: anyaivanova/.com

Anticorpo a fluorescenza indiretta

Rispetto alla tecnica a fase singola utilizzata per la DIF, l’IF indiretta (IIF) o FA indiretta (IFA) è un processo a due fasi che inizia con l’applicazione di un anticorpo primario non marcato sul campione che è diretto contro un antigene bersaglio. La seconda fase dell’IIF comporta l’uso di un anticorpo secondario marcato con la fluorescenza e diretto contro la porzione Fc dell’anticorpo primario.

Anche se l’IIF è considerata più complicata della DIF, poiché richiede più tempo per essere completata e l’uso di due anticorpi compatibili, è superiore in termini di capacità di sensibilità.

Alcune applicazioni cliniche comuni dei test IFA includono quelle usate per la diagnosi della sifilide. Per questo tipo di test IFA, le cellule di T. palladium precedentemente isolate da un animale da ricerca vengono isolate e poste sulla superficie di un vetrino. Un siero che è stato acquisito da un paziente viene poi sparso sulle cellule di T. palladium per permettere agli anticorpi anti-treponemici, se presenti, di legarsi agli antigeni fissati.

Dopo che il campione di siero del paziente viene lavato via, viene aggiunto un anticorpo secondario che è stato marcato con un fluoroforo. Un risultato positivo alla sifilide illuminerà tutti i complessi anticorpo secondario-fluoroforo coniugato.

Un altro tipo di IFA ampiamente utilizzato in ambito clinico è quello utilizzato per la diagnosi del lupus eritematoso sistemico (LES). I pazienti con il LES, che è una malattia autoimmune, avranno un livello aumentato di autoanticorpi anti-nucleo (ANA) circolanti che sono diretti sia contro il DNA che contro varie proteine che si legano al DNA.

Per questo tipo di test IFA, le cellule vengono coltivate e poi poste su un vetrino. Ogni vetrino viene poi incubato con una concentrazione diversa dell’anticorpo del paziente, che viene poi lavato per rimuovere le proteine non legate.

Dopo la fase di lavaggio, un anticorpo secondario marcato con fluorescenza, che per il test ANA sarà un IgG anti-umano, viene aggiunto ai vetrini e lasciato incubare. Un titolo di ANA nel siero viene poi ottenuto dalla più alta diluizione di siero che ha mostrato la fluorescenza e usato per determinare una diagnosi di SLE.

Citometria a flusso

Il terzo tipo di tecnica con anticorpi fluorescenti include la citometria a flusso, che è un sistema automatico di conteggio delle cellule che può essere usato per quantificare cellule specifiche presenti in miscele complesse come il sangue o il siero.

Un tipico esperimento di citometria a flusso inizierà con l’incubazione di un anticorpo marcato con fluorescenza che è mirato contro una specifica sottopopolazione di cellule, come l’anti-CD4, che può legarsi alla glicoproteina CD4 che si trova sulla superficie di varie cellule immunitarie tra cui le cellule T helper, monociti e macrofagi. La citometria a flusso può anche quantificare la presenza di più tipi di cellule utilizzando i produttori di cellule appropriate.

Dopo che l’incubazione è stata completata, il campione viene introdotto nel citometro a flusso. All’interno di questa macchina, uno stretto capillare costringe le cellule presenti all’interno del campione a muoversi in un unico file. Mentre le cellule si muovono attraverso il capillare, un laser viene utilizzato per attivare ed eccitare tutte le cellule che sono state marcate con il fluoroforo.

L’intensità di fluorescenza di ogni cellula eccitata viene quindi misurata da entrambi i rivelatori a diffusione laterale e in avanti e rappresentata su un istogramma per l’analisi. A parte gli scopi di quantificazione, sia la citometria a flusso che l’immunofluorescenza possono essere utilizzate per ordinare le cellule in sottopopolazioni purificate per scopi di ricerca attraverso una tecnica nota come fluorescence-activated cell sorter (FACS).

• Odell, I. D., & Cook, D. (2013). Tecniche di immunofluorescenza. Journal of Investigative Dermatology 133. doi:10.1038/jid.2012.455.
• Parker, N., Schneegurt, M., Tu, A. T., et al. (2016). Capitolo 20.5 Tecniche di anticorpi fluorescenti. In: Microbiologia. Accessed from https://openstax.org/books/microbiology/pages/20-5-fluorescent-antibody-techniques.
• Betterle, C., & Zanchetta, R. (2012). Le tecniche di immunofluorescenza nella diagnosi delle malattie autoimmuni endocrine. Autoimmunità Highlights 3(2); 67-78. doi:10.1007/s13317-012-0034-3.

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Written by

Benedette Cuffari

Dopo aver completato il suo Bachelor of Science in Toxicology con due minori in spagnolo e chimica nel 2016, Benedette ha continuato i suoi studi per completare il suo Master of Science in Tossicologia nel maggio del 2018. Durante la scuola di specializzazione, Benedette ha studiato la dermatotossicità della mecloretamina e della bendamustina; due agenti alchilanti a base di senape azotata che vengono utilizzati nella terapia antitumorale.

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