Strains of Streptococcus pyogenes from Severe Invasive Infections Bind HEp2 and HaCaT Cells More Avidly than Strains from Uncomplicated Infections

Streptococcus pyogenes (streptococco di gruppo A) è un agente eziologico di diverse malattie umane, tra cui faringite, piodermite e gravi malattie invasive. Inoltre, l’agente patogeno è associato a sequele potenzialmente letali come la glomerulonefrite post-streptococcica e la febbre reumatica acuta. Nel Territorio del Nord (NT) dell’Australia l’incidenza della febbre reumatica acuta è molto alta tra la popolazione indigena (3), nonostante un basso tasso di isolamento di GAS nella gola. Inoltre, la piodermite da infezione da GAS è estremamente comune e la glomerulonefrite poststreptococcica è endemica in molte comunità aborigene remote (4, 7). Mentre il trasporto asintomatico nella gola è spesso il serbatoio riportato per i ceppi associati alla malattia invasiva (5), nelle popolazioni dove l’impetigine è endemica, come nelle comunità aborigene del NT, il serbatoio primario è la pelle. Indipendentemente da quale tessuto sia il sito primario di infezione, il primo evento che il patogeno deve raggiungere è l’adesione alle cellule dell’ospite. Il genoma di S. pyogenes codifica numerosi geni che potrebbero essere considerati come codificanti le adesine. Questi geni sono altamente regolati e i singoli ceppi non hanno il potenziale genetico per codificare tutte queste proteine. Le adesine includono la proteina M (una molecola antifagocitica), la capsula e le proteine leganti la fibronectina. Ci sono molte diverse proteine leganti la fibronectina, come SfbI (8, 12), PrtF2 (9, 10), Fbp54 (2), e SfbII (11). La capacità di adesione di un singolo ceppo potrebbe variare a seconda del repertorio di geni per le adesine che il ceppo possiede e il loro livello di espressione. Questo a sua volta potrebbe riflettere le differenze nella capacità di colonizzare e infettare in modo persistente diversi siti tissutali. Un corollario di questo è che gli isolati da diversi siti di tessuto possono mostrare differenze nella capacità di adesione. Per testare questo, abbiamo determinato il grado di legame degli isolati di GAS dalla pelle, dalla gola e dal sangue alle linee cellulari HEp2 e HaCaT, che rappresentano cellule epiteliali laringee umane e cheratinociti, rispettivamente.

GAS isolati dal NT sono stati raccolti tra il 1990 e il 2002. I 72 ceppi analizzati in questo studio sono stati isolati da sangue (n = 26), pelle (n = 22) e gola (n = 24) (tabella 1). Gli isolati di sangue provenivano da malattie gravi, mentre i restanti ceppi provenivano da infezioni non complicate. Gli isolati sono stati tipizzati come descritto in precedenza (6). La tipizzazione di Vir coinvolge il polimorfismo di lunghezza del frammento di restrizione del regolatore mga, che include il gene per la proteina M altamente variabile. Per garantire l’inclusione di ceppi epidemiologicamente non correlati, è stato incluso un isolato rappresentativo di ogni tipo di Vir. Le colture sono state coltivate durante la notte a 37°C in un agitatore orbitale fino alla fase stazionaria in brodo Todd-Hewitt (Oxoid, Basingstoke, Regno Unito) integrato con 1% di estratto di lievito. Per preparare l’inoculo di GAS per i saggi di aderenza, colture durante la notte sono stati centrifugati, e il pellet sono stati lavati in fosfato-buffered salina (PBS; Life Technologies Gibco BRL, New York, N.Y.) e risospeso in senza siero e senza antibiotici RPMI 1640 media (Life Technologies) per una densità ottica a 600 nm di 0,05. Questo rappresenta circa 1 × 107 a 1,5 × 107 batteri per ml.

Le cellule epiteliali laringee umane (HEp2) sono state mantenute in RPMI 1640 medium integrato con 10% di siero fetale di vitello (Life Technologies), 1% Fungizone (Life Technologies), 20 μg di vancomicina HCl (David Bull Laboratories, Sydney, Australia) per ml, e 100 μg di streptomicina solfato (Sigma, St. Louis, Mo.) per ml. I cheratinociti della pelle umana adulta (cellule HaCaT) sono stati mantenuti in mezzo Dulbecco Eagle modificato (Life Technologies) integrato con il 10% di siero fetale di vitello inattivato al calore. Per i saggi di aderenza, ∼105 cellule/ml sono state seminate su coprioggetti di vetro di 12 mm di diametro sul fondo di piastre di coltura di tessuti a 24 pozzetti (Nunc, Roskilde, Danimarca). Dopo una crescita notturna a 37°C in atmosfera CO2 al 5%, le cellule sono state lavate con PBS (pH 7.4) e inoculate con 500 μl di inoculo di GAS. Dopo 2 ore di incubazione a 37 ° C, i coprioggetti sono stati lavati cinque volte con l’aggiunta di 1 ml di PBS a ciascun pozzo, e dopo una delicata miscelazione, la soluzione di lavaggio è stato rimosso mediante aspirazione. Dopo la rimozione dei batteri non aderenti, le cellule ospiti e i batteri aderenti sono stati fissati con metanolo al 95% e asciugati all’aria. Dopo il fissaggio a caldo, i coprioggetti sono stati posti su vetrini e colorati di Gram per la visualizzazione in immersione in olio. In ogni esperimento, le cellule in diversi campi casuali sono stati analizzati, e l’attaccamento è stato espresso come il numero medio di catene GAS per cella. Tutti i saggi sono stati eseguiti in duplicato, e il legame medio è stato determinato per ogni ceppo. Tutte le analisi statistiche sono state eseguite con Stata Statistics/Data Analysis programma versione 7.0 (Stata Corporation, College Station, Tex.). I dati sono stati analizzati con test t.

I ceppi di gas hanno aderito a entrambi i tipi di cellule, e il grado di legame varia da ceppo a ceppo (Tabella 1). C’era una buona correlazione tra esperimenti indipendenti con 20 isolati ripetuti a due intervalli di tempo (dati non mostrati), suggerendo l’avidità di legame è riproducibile e ceppo specifico. Nel complesso, il legame GAS alle cellule HaCaT è maggiore rispetto alle cellule HEp2 (P < 0,05). Quando i dati della tabella 1 sono stati separati in base al sito del tessuto di isolamento, una media di 270 catene di ceppi GAS dal sangue legato a 50 cellule HaCaT (Fig. 1). Al contrario, gli isolati della pelle e della gola hanno legato in media solo 169 e 178 catene per 50 cellule HaCaT, rispettivamente. Queste differenze sono statisticamente significative (P = 0,0044 e 0,0063, rispettivamente). È interessante notare che per le cellule HEp2 le differenze sono meno pronunciate e non statisticamente significative. Tuttavia, quando i dati sono stati rianalizzati in base alle infezioni invasive rispetto a quelle non complicate, combinando i dati per gli isolati della pelle e della gola, sono state trovate differenze significative tra le due categorie in entrambe le linee cellulari (P = 0,0011 per HaCaT; P = 0,0238 per HEp2).

I lavori precedenti di questo laboratorio hanno dimostrato che molti ceppi comunemente in circolazione di S. pyogenes potrebbero causare malattie invasive con la pelle come sito primario di infezione (1). Queste osservazioni sono coerenti con i presenti risultati di maggiore avidità dei ceppi NT GAS per HaCaT rispetto alle linee cellulari HEp2 e gli isolati di sangue in grado di legarsi in numero maggiore rispetto agli isolati da infezioni non complicate. Le possibili spiegazioni per l’alta propensione all’adesione degli isolati di sangue di S. pyogenes includono differenze sia genotipiche che fenotipiche tra gli isolati provenienti da fonti di malattie invasive e non invasive. Sono necessari ulteriori studi per definire la natura di questa avidità di legame e per determinare se è coerente all’interno delle popolazioni clonali.