Materiali e metodi
partecipanti
I soggetti erano 83 bambini con ADHD (75% maschi) e 72 bambini TD (51% maschi), di età compresa tra 6 e 13 anni. I criteri di inclusione per il gruppo ADHD erano: (a) una diagnosi clinica di ADHD secondo i criteri del DSM-IV, (b) la conferma di questa diagnosi dal Diagnostic Interview Schedule for Children, quarta edizione, somministrato ai genitori (DISC-IV-P; ), (c) sintomi significativi di ADHD, come indicato dalle valutazioni dei genitori >90° percentile su almeno una delle scale ADHD (scale di disattenzione e iperattività/impulsività) della Disruptive Behaviour Disorder Rating Scale (DBDRS; ), e (d) sintomi ADHD pervasivi, come indicato dalle valutazioni degli insegnanti >75° percentile su almeno una delle scale ADHD della DBDRS. Avere una diagnosi comorbida (per esempio ODD o ASD) non era un criterio di esclusione, né il trattamento con farmaci stimolanti. I bambini in trattamento con farmaci stimolanti (N = 50, 60% del gruppo ADHD) hanno interrotto l’uso di farmaci 24 ore prima del test, al fine di consentire il washout completo, e durante la partecipazione al nostro studio. I criteri di inclusione per il gruppo TD erano: (a) assenza di una diagnosi clinica di qualsiasi disturbo dello sviluppo o del comportamento (compresi ADHD e ODD), e (b) punteggi <90° percentile su entrambe le scale ADHD valutate dai genitori e dagli insegnanti del DBDRS.
Materiali
Comportamento.
I genitori dei bambini idonei all’inclusione nel gruppo ADHD sono stati valutati con la sezione disturbo di comportamento dirompente del DISC-IV-P. Il DISC-IV-P è un’intervista diagnostica standardizzata ampiamente utilizzata per la valutazione dei disturbi psichiatrici infantili DSM-IV, con adeguate proprietà psicometriche.
I genitori e gli insegnanti dei bambini in entrambi i gruppi ADHD e TD hanno completato il DBDRS per valutare i sintomi ADHD e i sintomi di ODD e CD. Il DBDRS contiene quattro scale che misurano i sintomi di disattenzione, iperattività/impulsività, ODD e CD su una scala Likert a 4 punti (da 0 a 3), con punteggi più alti che indicano sintomi peggiori. Adeguate proprietà psicometriche sono state riportate per il DBDRS.
Le forze e le debolezze dell’ADHD-sintomi e scala di valutazione del comportamento normale (SWAN; ) è stato completato da genitori e insegnanti per valutare i sintomi di ADHD. Questo questionario ampiamente utilizzato contiene due sottoscale: la scala della disattenzione e la scala dell’iperattività/impulsività, ognuna delle quali comprende 9 item. Gli item sono valutati su una scala Likert a 7 punti (che va da -3 a +3), con punteggi più alti che indicano sintomi peggiori. Gli item sono basati sui sintomi DSM-IV dell’ADHD, ma riflettono entrambe le estremità (forte e debole) del comportamento descritto in ogni sintomo ADHD. I punteggi medi di entrambe le sottoscale sono stati utilizzati come variabili dipendenti. Adeguate proprietà psicometriche sono state riportate per lo SWAN.
I sintomi dell’ADHD sono stati valutati utilizzando la Social Responsiveness Scale (SRS; ) a 65 voci, completata da genitori e insegnanti. Gli elementi della SRS sono basati sui domini dei sintomi DSM-IV dell’ASD, tra cui la compromissione dell’interazione sociale, deficit comunicativi e modelli ristretti/stereotipici di comportamenti o interessi. La SRS usa una scala Likert a 4 punti (che va da 0 a 3), e il punteggio sommato degli item sulla scala totale SRS è stato usato come misura dipendente, con punteggi più alti che indicano sintomi peggiori. L’SRS ha proprietà psicometriche adeguate.
Punti di sangue.
Per studiare le concentrazioni di triptofano, tirosina e fenilalanina nel sangue, è stata utilizzata la tecnica dei punti di sangue essiccati. La raccolta di macchie di sangue è meno invasiva per i bambini rispetto al prelievo di sangue venoso e la tecnica delle macchie di sangue essiccate è sufficientemente robusta e stabile per scopi diagnostici. Le concentrazioni di AAA nelle macchie di sangue sono altamente correlate alle concentrazioni di AAA nel siero (rs che vanno da .86 a .96). Una macchia di sangue di ogni bambino è stata raccolta utilizzando una lancetta di sicurezza monouso. Tre gocce di sangue sono state macchiate su una carta per la colorazione del sangue. Un punzone di 5,5 mm di una macchia di sangue secca è stato mescolato con 100μl di una soluzione standard interna (contenente 29μM di L-fenilalanina-D5, 6μM di L-tirosina-D4 e 5μM di L-triptofano-D5) e 400μl di metanolo in una fiala per gascromatografia (GC-vial) e agitato per 15 minuti in un bagno ultrasonico. Il surnatante è stato trasferito in un altro GC-vial ed evaporato sotto azoto a 30°C. Successivamente, il campione è stato butilato con 100μl di cloruro di acetile al 5,5% (in n-butanolo) a 60°C per 15 minuti. Successivamente, lo strato di butanolo è stato evaporato sotto azoto (a 30°C) e il residuo è stato sciolto in 500μl di acetonitrile. Le concentrazioni delle macchie di sangue di triptofano, tirosina e fenilalanina sono state determinate mediante cromatografia liquida-tandem positiva (LC-MS/MS), utilizzando uno spettrometro di massa a triplo quadrupolo API 3000 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), accoppiato a un sistema di cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) (Perkin Elmer Series 200, Shelton, USA). Tre μl di campione sono stati iniettati su una colonna C18 simmetrica (3.9*150mm, 5μm; Waters, Milford, MA, USA) ed eluiti con un flusso di 1ml/min di acetonitrile al 75% (contenente 0.4% di acido formico). Il triptofano, la tirosina e la fenilalanina si sono eluiti entro 1 minuto e sono stati misurati utilizzando le transizioni: rapporto massa/carica (m/z) 261.2→159.2 (triptofano), m/z 238.2→136.2 (tirosina) e m/z 222.2→120.2 (fenilalanina). Tutti i dati LC-MS/MS ottenuti sono stati acquisiti ed elaborati utilizzando il software Analyst 1.4.2 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Le concentrazioni delle macchie di sangue di triptofano, tirosina e fenilalanina sono state espresse in μmole/L. L’affidabilità della LC-MS/MS è stata confermata esaminando la varianza inter-saggio (5-10%), la varianza intra-saggio (8-10%) e il recupero (90-112%).
Assunzione di proteine alimentari.
L’assunzione giornaliera di proteine è stata valutata durante tre giorni, utilizzando un diario alimentare riferito dai genitori. Sono state fornite registrazioni e istruzioni dietetiche standardizzate. I genitori sono stati istruiti a registrare tutti gli alimenti e le bevande consumati nel registro alimentare e ad esprimere le quantità consumate nel modo più accurato possibile. La quantità di proteine assunte (grammi/giorno) è stata calcolata sulla base di una versione computerizzata del database olandese sulla composizione degli alimenti. Il database olandese sulla composizione degli alimenti contiene oltre 2000 prodotti alimentari con informazioni sulla composizione nutrizionale di questi prodotti. Il database è ampiamente utilizzato per scopi scientifici (ad esempio).
Urine.
Al fine di esaminare le concentrazioni urinarie di AAA, i partecipanti hanno raccolto tutte le urine escrete entro 18 ore consecutive (dopo l’orario scolastico) in un contenitore di raccolta delle urine. Durante la raccolta delle urine, il contenitore è stato conservato in un frigorifero (<5°C). Un campione di 10 ml è stato inviato a un laboratorio per l’analisi, dove il campione è stato conservato a -20°C. Per l’analisi del triptofano nelle urine è stata utilizzata una tecnica HPLC con rilevamento della fluorescenza. Le concentrazioni di tirosina e fenilalanina nelle urine sono state determinate utilizzando un analizzatore di aminoacidi Biochrom. Le concentrazioni urinarie di triptofano, tirosina e fenilalanina sono state espresse da un rapporto μmole/volume totale delle urine, per escludere effetti di poliuria o oliguria. L’affidabilità della tecnica HPLC è stata confermata esaminando la precisione delle analisi, che è del 2,25% per il triptofano (deviazione standard relativa), e dell’1,50% per la tirosina e la fenilalanina. Ci sono alte correlazioni tra le concentrazioni di aminoacidi nei campioni di 12 ore e nei campioni di 24 ore, indicando che non c’è variazione diurna nell’escrezione di aminoacidi, convalidando l’uso di un campione di 18 ore nello studio attuale.
Procedura
Questo studio ha ricevuto l’approvazione del comitato etico medico locale della VU University Medical Center Amsterdam, Paesi Bassi (#NL39922.029.12), ed è stato eseguito in conformità con le norme etiche come stabilito nella Dichiarazione di Helsinki del 1964 e le sue successive modifiche. Il consenso informato scritto è stato ottenuto dai genitori di tutti i bambini, e dei bambini ≥12 anni, prima della partecipazione. I bambini con ADHD sono stati reclutati da ambulatori di salute mentale, attraverso l’associazione dei genitori per i bambini con problemi comportamentali, e attraverso un sito web di ricerca universitaria. Il gruppo TD è stato reclutato dalle scuole primarie situate in tutto il paese. I bambini che assumevano farmaci stimolanti hanno interrotto l’uso di farmaci un giorno prima della partecipazione (giorno 0), per garantire un washout completo, e durante la valutazione del sangue, delle urine e dell’assunzione di cibo (dal giorno 1 al giorno 3). Il giorno 1 la macchia di sangue è stata raccolta al mattino presto, per escludere gli effetti della variazione diurna delle concentrazioni di AAA nel sangue. Lo stesso giorno, dopo l’orario scolastico, è iniziata la raccolta delle urine che è continuata per le 18 ore successive, fino a quando il bambino sarebbe tornato a scuola la mattina successiva (giorno 2). La mattina presto del giorno 1 i genitori hanno ricevuto istruzioni dettagliate su come compilare la cartella alimentare e su come raccogliere le urine del loro bambino. Dopo le istruzioni, i genitori iniziarono a registrare l’assunzione di cibo del loro bambino, cosa che continuò per i tre giorni seguenti (dal giorno 1 al giorno 3). I genitori e gli insegnanti sono stati invitati a compilare i questionari su un sito web protetto. Tutti i dati sono stati raccolti tra febbraio 2013 e luglio 2014. Il gruppo ADHD e TD sono stati reclutati contemporaneamente, per controllare i possibili effetti stagionali sull’assunzione di cibo o sul metabolismo AAA.
Analisi dei dati
Tutte le analisi statistiche sono state effettuate utilizzando R, versione 3.2.1. Tutte le variabili sono state ispezionate su outlier e valori mancanti per il gruppo ADHD e TD separatamente. Winsorising è stato applicato agli outlier, questi sono stati sostituiti con un valore di una unità più grande (o più piccolo) del precedente punteggio più estremo nella distribuzione del gruppo . I dati mancanti nelle concentrazioni urinarie, nei dati dietetici e nei dati comportamentali sono stati distribuiti in modo casuale e sostituiti utilizzando le medie di gruppo. Per i punti di sangue non c’erano dati mancanti. Tutti i dati erano distribuiti normalmente, tranne che per i sintomi CD. Le differenze di gruppo nel sesso sono state esaminate usando un test chi-quadrato, e le differenze di gruppo nell’età e nel funzionamento comportamentale sono state esaminate usando test t a campioni indipendenti.
Per testare la prima ipotesi, le differenze di gruppo nelle concentrazioni di macchie di sangue AAA sono state valutate usando l’analisi delle varianze (ANOVA) con il gruppo (ADHD o TD) come fattore fisso. Le dimensioni dell’effetto sono state calcolate in termini di eta quadrato parziale e interpretate come piccole (> .01), medie (>.06) o grandi (>.14). Inoltre, sono stati calcolati gli odds ratio, che esprimevano il rischio di essere diagnosticati con ADHD con concentrazioni di AAA inferiori alla media. I dati normativi per le concentrazioni di AAA sono stati derivati da un ampio campione di bambini dai 6 ai 13 anni (N = 104, 52% maschi) (dati non pubblicati, informazioni sul campione e risultati disponibili presso gli autori). Per ogni AAA, le concentrazioni corrispondenti al 16° percentile più basso (M-1 SD) del campione normativo sono state utilizzate come valore di soglia per definire le concentrazioni AAA inferiori alla media (per il triptofano 45 μmole/L, la tirosina 39 μmole/L e la fenilalanina 47 μmole/L). Gli odds ratio sono stati calcolati con il loro intervallo di confidenza del 95% e il test esatto di Fisher è stato eseguito per esaminare la significatività degli odds ratio.
Per verificare la seconda ipotesi, i coefficienti di correlazione prodotto-momento di Pearson hanno studiato la relazione tra le concentrazioni di AAA nel sangue e i sintomi di ADHD valutati sia dai genitori che dagli insegnanti. La grandezza dei coefficienti di correlazione è stata interpretata come piccola (>.10), media (>.30) o grande (>.50). I dati del gruppo ADHD e del gruppo TD sono stati combinati per massimizzare la variabilità nelle misure dei sintomi ADHD.
Per testare la terza ipotesi, le analisi di correlazione tra le concentrazioni di AAA nel sangue e l’ingestione di proteine e le concentrazioni urinarie di AAA sono state effettuate nell’intero campione. Abbiamo anche esaminato se c’erano differenze di gruppo nell’ingestione di proteine e nelle concentrazioni urinarie di AAA usando le ANOVA con il gruppo (ADHD o TD) come fattore fisso. Infine, le analisi correlazionali hanno valutato se le concentrazioni di AAA nel sangue erano legate ai sintomi riferiti dai genitori e dagli insegnanti dei disturbi psichiatrici in comorbilità (coefficienti di correlazione Pearson prodotto-momento per ODD e ASD, coefficienti di correlazione di rango di Spearman per CD). Se i sintomi di ODD, CD o ASD sono stati trovati correlati alle concentrazioni di AAA, le analisi precedenti sono state ripetute con questi sintomi inseriti come covariate. Per correggere i test multipli, il livello alfa delle analisi di correlazione è stato aggiustato secondo la procedura Bonferroni per ogni dominio di risultato; sintomi ADHD (12 analisi, quindi p = .004), potenziali determinanti delle anomalie AAA nelle macchie di sangue (12 analisi, quindi p = .004), e sintomi di disturbi psichiatrici comorbidi (18 analisi, quindi p = .003). Sono riportati i risultati aggiustati per Bonferroni.