Obiettivi:

1. Differenziare le due principali categorie di batteri: Gram positivo e Gram negativo.
2. Capire come la reazione di colorazione Gram colpisce i batteri Gram positivi e Gram negativi in base alle differenze biochimiche e strutturali delle loro pareti cellulari.

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La colorazione è una tecnica ausiliaria usata nelle tecniche microscopiche utilizzate per migliorare la chiarezza dell’immagine microscopica.Macchie e coloranti sono ampiamente usati in campo scientifico per evidenziare la struttura dei campioni biologici, cellule, tessuti ecc.

La procedura di colorazione più usata in microbiologia è la macchia di Gram, scoperta dallo scienziato e medico danese Hans Christian Joachim Gram nel 1884. La colorazione di Gram è una tecnica di colorazione differenziale che differenzia i batteri in due gruppi: gram-positivi e gram-negativi. La procedura si basa sulla capacità dei microrganismi di trattenere il colore delle macchie usate durante la reazione di colorazione di Gram. I batteri gram-negativi vengono decolorati dall’alcol, perdendo il colore della macchia primaria, il viola. I batteri gram-positivi non vengono decolorati dall’alcool e rimangono viola. Dopo la fase di decolorazione, viene utilizzata una controcolorazione per conferire un colore rosa agli organismi gram-negativi decolorati.

Fig: Hans Christian Joachim Gram

Importanza della colorazione di Gram:

La colorazione di Gram è un passo preliminare molto importante nella caratterizzazione e classificazione iniziale dei batteri. È anche una procedura chiave nell’identificazione dei batteri basata sulle caratteristiche di colorazione, che permette di esaminare i batteri con un microscopio ottico. I batteri presenti in uno striscio non colorato sono invisibili se visti al microscopio ottico. Una volta colorati, è possibile osservare anche la morfologia e la disposizione dei batteri. Inoltre, è anche un passo importante nello screening di agenti infettivi in campioni clinici come gli strisci diretti di un paziente.

La procedura di colorazione di Gram permette ai batteri di mantenere il colore delle macchie, in base alle differenze nelle proprietà chimiche e fisiche della parete cellulare.

1. Batteri Gram positivi: i batteri Gram positivi sono i più comuni tra i batteri che hanno un’infezione. Batteri Gram positivi: Macchia viola scuro a causa della ritenzione del colorante primario chiamato Crystal Violet nella parete cellulare.

Esempio: Staphylococcus aureus

Fig: Batteri Gram positivi

2. Batteri Gram negativi: Macchiano di rosso o rosa a causa della ritenzione del colorante di controcolorazione chiamato Safranin.

Esempio: Escherichia coli

Fig: Batteri Gram negativi

Morfologia batterica:

I batteri sono microorganismi unicellulari molto piccoli ubiquitari in natura. Hanno dimensioni micrometriche (1µm = 10-6 m). Hanno pareti cellulari composte da peptidoglicano e si riproducono per fissione binaria. I batteri variano nelle loro caratteristiche morfologiche.

Le morfologie più comuni sono:

Coccus (pleura: Cocci):

Batteri sferici; possono presentarsi in coppia (diplococchi), in gruppi di quattro (tetracocci), in grappoli a forma di uva (stafilococchi), in catene (streptococchi) o in disposizioni cubiche di otto o più (sarcine).

Per esempio: Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes

Bacillus (pleura: Bacilli):

Batteri a forma di asta; generalmente si presentano singolarmente, ma possono occasionalmente essere trovati in coppie (diplo-bacilli) o catene (streptobacilli).

Per esempio: Bacillus cereus, Clostridium tetani

Spirillum (pleura: Spirilla):

Batteri a forma di spirale

Ad esempio: Spirillum, Vibrio, specie di Spirochete.

Alcuni batteri hanno altre forme come:

Coccobacilli: Forma sferica o ovoidale allungata.

Filamentosi: Bacilli che si presentano in lunghe catene o fili.

Fusiformi: Bacilli con estremità affusolate.

Fig: Diversa morfologia batterica

Meccanismo della macchia di Gram:

Parete cellulare positiva:

I batteri Gram-positivi hanno una parete cellulare a maglia spessa costituita da peptidoglicano (50-90% della parete cellulare), che si macchia di viola. Il peptidoglicano è principalmente un polisaccaride composto da due subunità chiamate N-acetil glucosamina e acido N-acetil muramico. Man mano che si formano gli strati adiacenti di peptidoglicano, essi sono legati in modo incrociato da brevi catene di peptidi per mezzo di un enzima transpeptidasi, dando luogo alla forma e alla rigidità della parete cellulare. Lo spesso strato di peptidoglicano degli organismi Gram-positivi permette a questi organismi di trattenere il complesso cristallo-iodio e colora le cellule di viola.

L’acido lipoteico (LTA) è un altro importante costituente della parete cellulare dei batteri Gram-positivi che è incorporato nello strato di peptidoglicano. Consiste di acidi teicoici che sono lunghe catene di ribitolo fosfato ancorate al bilayer lipidico attraverso un gliceride. Agisce come regolatore degli enzimi autolitici della parete (muramidasi: Enzimi batterici situati nella parete cellulare che causano la disintegrazione della cellula a seguito di lesioni o morte.)

Rilevanza medica della parete cellulare Gram Positiva:

LTA ha anche proprietà antigeniche che stimolano risposte immunitarie specifiche quando viene rilasciato dalla parete cellulare dopo la morte cellulare. La morte cellulare è dovuta principalmente alla lisi indotta dalle attività lisozimali, dai peptidi cationici dei leucociti o dagli antibiotici beta-lattamici.

Parete cellulare negativa:

I batteri Gram-negativi hanno uno strato più sottile di peptidoglicano (10% della parete cellulare) e perdono il complesso cristallo-iodio durante la decolorazione con il risciacquo dell’alcool, ma conservano la controcolorazione Safranin, apparendo così rossastri o rosa. Hanno anche un’ulteriore membrana esterna che contiene lipidi, che è separata dalla parete cellulare tramite lo spazio periplasmatico.

Rilevanza medica della parete cellulare dei Gram negativi:

La parete cellulare dei batteri Gram negativi è spesso un fattore di virulenza che permette ai batteri patogeni di causare malattie. La virulenza dei batteri Gram-negativi è spesso associata a certi componenti della parete cellulare, in particolare il lipopolisaccaride (altrimenti noto come LPS o endotossina). Nell’uomo, l’LPS suscita una risposta immunitaria innata caratterizzata dalla produzione di citochine e dall’attivazione del sistema immunitario. L’infiammazione si verifica come risultato della produzione di citochine, che può anche produrre la tossicità dell’ospite.

Reazione alla macchia:

Le quattro fasi fondamentali della colorazione di Gram sono:

1) Applicazione del colorante primario Crystal Violet (CV) ad uno striscio di coltura batterica fissato a caldo.

CV si dissocia in soluzioni acquose in ioni CV+ e Cl -. Questi due ioni poi penetrano attraverso la parete cellulare e la membrana cellulare delle cellule Gram-positive e Gram-negative. Gli ioni CV+ interagiscono poi con i componenti batterici caricati negativamente e colorano le cellule batteriche di viola.

2) Aggiunta dello iodio di Gram.

Lo iodio (I – o I3 -) agisce come mordente e come agente di cattura. Un mordente è una sostanza che aumenta l’affinità della parete cellulare per una macchia legandosi alla macchia primaria, formando così un complesso insolubile che viene intrappolato nella parete cellulare. Nella reazione della colorazione di Gram, il violetto di cristallo e lo iodio formano un complesso insolubile (CV-I) che serve a trasformare lo striscio in un colore viola scuro. In questa fase, tutte le cellule diventano viola.

3) Decolorazione con alcol etilico al 95%.

L’alcol o l’acetone dissolvono la membrana esterna lipidica dei batteri Gram negativi, lasciando così esposto lo strato di peptidoglicano e aumentando la porosità della parete cellulare. Il complesso CV-I viene quindi lavato via dal sottile strato di peptidoglicano, lasciando i batteri Gram negativi incolori.

D’altra parte, l’alcol ha un effetto disidratante sulle pareti cellulari dei batteri Gram positivi che fa restringere i pori della parete cellulare. Il complesso CV-I si lega strettamente alla parete cellulare multistrato e altamente reticolata dei Gram positivi, colorando così le cellule di viola.

La fase di decolorazione deve essere eseguita con attenzione, altrimenti può verificarsi una decolorazione eccessiva. Questa fase è critica e deve essere temporizzata correttamente, altrimenti la macchia di violetto di cristallo sarà rimossa dalle cellule Gram-positive. Se l’agente decolorante viene applicato sulla cellula per troppo tempo, gli organismi Gram-positivi appariranno Gram-negativi. La sotto-decolorazione si verifica quando l’alcool non viene lasciato abbastanza a lungo per lavare via il complesso CV-I dalle cellule Gram-negative, con il risultato che i batteri Gram-negativi appaiono Gram-positivi.

4) Contrasto con Safranin

Le cellule Gram negative decolorate possono essere rese visibili con un adeguato contro-colore, che è solitamente safranina caricata positivamente, che le colora di rosa. Il colore rosa che aderisce ai batteri Gram positivi è mascherato dal porpora del violetto di cristallo (la fuschin di base è talvolta usata al posto della safranina in rare situazioni).

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