Il numero di copie di O6-Methylguanine-DNA Methyltransferase (MGMT) metilato viene determinato in relazione al numero di copie di beta-actina (ACTB) mediante reazione a catena della polimerasi specifica per la metilazione in tempo reale (MSP). A tal fine, il contenuto del tessuto tumorale è arricchito da una microdissezione manuale seguita dall’estrazione del DNA. Il DNA viene quantificato utilizzando Picogreen e modificato dal trattamento con bisolfito che causa la conversione delle citosine non metilate in uracyl mentre le citosine metilate rimangono invariate. Successivamente, viene eseguita una PCR specifica per la metilazione (MSP) in tempo reale sullo strumento Quantstudio 5 per quantificare il numero di copie di MGMT e ACTB (1). Questa tecnica consiste nell’eseguire una PCR con rilevazione in tempo reale utilizzando il sistema di rilevazione amplifluor. I campioni con un numero di copie sconosciuto possono essere quantificati confrontando i loro valori Ct con quelli di una curva standard del plasmide.
Implicazione clinica
MGMT è un enzima di riparazione del DNA che è spesso disattivato dall’ipermetilazione nel cancro umano. Quando le cellule mancano dell’attività di MGMT, il danno al DNA non viene riparato correttamente rendendo un individuo più incline allo sviluppo del cancro. È interessante notare che questa mancanza di attività MGMT rende anche una cellula tumorale più sensibile alla radioterapia e a certi farmaci alchilanti come la temozolomide (2). Nello studio internazionale di convalida prognostico di fase III (RTOG 0525), il test MGMT ha identificato con successo i pazienti con glioblastoma di nuova diagnosi che hanno maggiori probabilità di vivere più a lungo e di avere un periodo di tempo libero da progressione più lungo dopo il trattamento con temozolomide (3-5). Recentemente, è stata pubblicata una nuova pubblicazione in cui sia i pazienti metilati che quelli della “zona grigia” hanno ottenuto risultati significativamente migliori per la sopravvivenza complessiva rispetto ai pazienti realmente non metilati (6).
Requisiti del campione
I campioni accettabili per il test sono campioni di tessuto di glioma fissati in formalina e inclusi in paraffina con un tempo di fissazione di 6-48 ore.
Volume
È preferibile un blocco di paraffina rappresentativo. In alternativa, sono accettate 5 sezioni di tessuto non colorate (1 vetrino di 5 µm di spessore per la colorazione H&E e un minimo di 4 vetrini di 5-10 µm di spessore per il test MGMT).
Istruzioni per la conservazione e la spedizione
Mantenere e spedire i campioni a temperatura ambiente.
Limitazioni
Per alcuni campioni, si otterrà un risultato non valido a causa di un numero insufficiente di copie ACTB in combinazione con un numero di copie MGMT inferiore al limite di rilevazione. Nella maggior parte dei casi, ciò si spiega con una quantità e/o qualità del DNA insufficiente. Per i campioni non validi con un numero di copie per MGMT e/o ACTB intorno al LOD/LOQ e al cut-off, si raccomanda di eseguire un retest partendo dal DNA trattato con bisolfito. Fissativi diversi dalla formalina o tempi di fissazione prolungati possono dare risultati inadeguati.
Requisiti speciali
Nessuno
Turn-Around Time
Da 5 a 7 giorni lavorativi rispettivamente per i vetrini e i blocchi di paraffina.
- Vlassenbroeck I et al. Convalida della PCR specifica per la metilazione in tempo reale per determinare la metilazione del promotore del gene O6-Methylguanine-DNA Methyltransferase nel glioma. J Mol Diagn. 2008 Jul;10(4):332-7
- Hegi ME et al. MGMT gene silencing and benefit from temozolomide in glioblastoma. N Engl J Med 2005 Mar 10;352(10):997-1003.
- Gilbert MR et al. Dose-densa di temozolomide per glioblastoma di nuova diagnosi: uno studio clinico randomizzato di fase III.(7). J Clin Oncol. 2013 Nov 10;31(32):4085-91.
- Malmström A et al. Temozolomide versus radioterapia standard di 6 settimane versus radioterapia ipofrazionata in pazienti di età superiore ai 60 anni con glioblastoma: il Nordic randomizzato, studio di fase 3. Lancet Oncol 2012 Sep; 13(9): 916-926.
- Wick W et al. Temozolomide chemioterapia da sola contro radioterapia da sola per l’astrocitoma maligno negli anziani: il NOA-08 randomizzato, studio di fase 3. Lancet Oncol 2012 Jul; 13(7): 707-715.
- Hegi ME et al. MGMT Promoter Methylation Cutoff con margine di sicurezza per la selezione dei pazienti di glioblastoma in studi che omettono Temozolomide. Un’analisi collettiva di quattro studi clinici. Clin Cancer Res 2019 Mar 15; 25(6): 1809-1816.
Aggiornato il 23 maggio 2019