Meccanismo di depolimerizzazione sinergica del filamento di actina a punta da parte della proteina associata alla ciclasi e della cofilina

Costruzioni di DNA

Tutte le proteine N-CAP del topo, N-CAP-GFP, CAP1 a lunghezza intera, il dominio HFD, la fusione GST del dominio HFD e il dominio ADF-H C-terminale di twinfilina, sono stati clonati nel vettore di espressione batterica pSUMOck4 (un gentile dono di Inari Kursula, Università di Bergen, Norvegia) per esprimere una proteina di fusione legata a SUMO che lascia un N-terminale nativo dopo la scissione con la proteasi SENP2. Per il dominio CARP e C-CAP costrutti, abbiamo usato pCoofy18 vettore di espressione batterica (un dono gentile da Addgene). Per i dettagli dei costrutti proteici e primer utilizzati per il clonaggio dei costrutti, vedere la tabella supplementare 2.

Espressione e purificazione proteine CAP e suoi frammenti

Tutte le proteine CAP del topo e suoi frammenti, ad eccezione di full-length CAP1, sono stati espressi a +22 ° C in LB auto-induzione media (AIMLB0210, Formedium) per 24 ore in BL21 (DE3) E. coli (da Novagen. coli (da Novagen).

Il topo CAP1 a lunghezza intera è stato espresso in mezzo LB usando cellule E. coli ArcticExpress (DE3). Per prima cosa, abbiamo inoculato una coltura starter contenente kanamicina (20 µg/ml) e gentamicina (20 µg/ml) che è stata incubata per 6 ore a +37 °C. La coltura principale da 3,6 l, contenente solo kanamicina (20 µg/ml), è stata inoculata e fatta crescere fino a una OD600 di ~0,4 a +37 °C agitando a 240 rpm. La temperatura di coltura è stata cambiata a +13 ° C per 1 h prima dell’espressione della proteina che è stata indotta dall’aggiunta di 0,26 mM IPTG per 46 h. Tutti i pellet batterici sono stati raccolti per centrifugazione, risospesi in 50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 25 mM imidazolo, pH 7,5, snap-congelato con N2 liquido e conservati a -80 ° C.

Tutte le proteine CAP e il dominio ADF-H di twinfilin sono stati purificati utilizzando un flusso di lavoro simile. In primo luogo, i batteri sono stati lisati mediante sonicazione in presenza di lisozima (0,5 mg/ml), DNAse (0,1 mg/ml) e inibitori della proteasi (200 µg/ml PMSF, 1 µg/ml leupeptina, 1 µg/ml aprotinina, 1 µg/ml pepstatin A; tutti da Sigma-Aldrich), e il lisato è stato chiarito mediante centrifugazione. Il surnatante è stato caricato in una colonna HisTrap HP Ni-NTA da 1 ml (GE Healthcare) e lavato ampiamente (>20 volumi di colonna) con 50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 25 mM imidazolo, pH 7.5. Le proteine sono state eluite con un gradiente di imidazolo 25-250 mM sulla macchina AKTA Pure (GE Healthcare). Le frazioni di picco sono state raggruppate e la proteasi SENP2 è stata aggiunta alla concentrazione finale di 40 µg/ml per la rimozione del SUMO-tag. Miscela è stato dializzato O / N a 4 ° C con tubi di dialisi SnakeSkin in 1 l di 20 mM HEPES, 300 mM NaCl, 2 mM DTT, pH 7,4 buffer. Il giorno successivo, il SUMO-tags scisso sono stati rimossi con Ni-NTA perline di agarosio (Qiagen) nei casi in cui il SUMO-tag e la proteina scissa erano di dimensioni uguali. Le proteine sono state concentrate con Amicon Ultra-4 10 kDa filtro centrifugo (Merck) e caricato in HiLoad 16/600 Superdex 200 gel colonna di filtrazione (GE Healthcare) equilibrato in 5 mM HEPES, 100 mM NaCl, 1 mM DTT, pH 7,4. Le frazioni di picco sono state raccolte, concentrate e congelate mediante congelamento a scatto in N2 per la conservazione a -80 °C.

Il CAP full-length è stato purificato con le seguenti eccezioni. Abbiamo usato una colonna HisTrap HP Ni-NTA da 5 ml invece di una colonna da 1 ml. Dopo la dialisi e la filtrazione su gel con la colonna di filtrazione su gel HiLoad 16/60 Superdex 200, le frazioni dei picchi principali sono state eseguite attraverso la colonna di filtrazione su gel Superose 6 aumentare 10/300 GL per ottenere una migliore separazione della miscela di stati oligomerici. Infine, i picchi principali da diverse corse sono stati combinati, concentrati a 5-min spin-intervalli utilizzando Amicon Ultra-4 30 kDa filtro centrifugo, e conservati come sopra. CARP e C-CAP proteine sono state purificate come sopra con l’eccezione di utilizzo di proteasi 3C (0,01 mg / ml) per tag cleavage.

Altre proteine

Attina muscolare di coniglio, actine etichettati, profilina, mouse cofilin-1, proteina capping, e biotina-gelsolina sono stati preparati come descritto nel rif. 16. L’ADP-actina è stata preparata come descritto in rif. 34. Brevemente, 30 µM ATP-G-actina soluzione contenente 0,3 mM glucosio e 1 unità / ml di esochinasi (Sigma) è stato dializzato contro nucleotide buffer di scambio (5 mM Tris-HCl, 0,1 mM MgCl2, 0,05 mM EGTA, 0,2 mM ADP, 1 mM DTT, pH 8,0) per 4 h a 4 ° C. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti utilizzando il muscolo di coniglio α-actin.

Actina ha puntato fine depolimerizzazione saggi

Misurazione del filamento di actina ha puntato fine tasso di depolimerizzazione è stata eseguita utilizzando un dispositivo microfluidico accoppiato ad una configurazione microscopia, come descritto 16. In breve, abbiamo preparato una camera con poli dimetil silossano (PDMS, Sylgard), che è stato montato su un vetrino pulito. Camere microfluidiche erano 20 µm di altezza. I tre ingressi e l’uscita erano collegati a tubi a pressione controllata riempiti con soluzioni di diversa composizione biochimica (dispositivo microfluidico Fluigent).

Dopo il montaggio, le camere sono state sciacquate con dH20 e F-buffer (5 mM HEPES pH 7.4, 100 mM KCl, 1 mM MgCl2, 0.2 mM EGTA, 0.4 mM CaCl2, 0.2 mM ATP, 10 mM DTT e 1 mM DABCO). La camera è stata poi esposta successivamente a: 150 µl di 0.1% biotina-BSA in F-buffer; 300 µl di 5% BSA; 150 µl di 3 µg/ml di neutravidina in F-buffer; e 10-100 µl di 1-3 pM biotina-gelsolina. Prima degli esperimenti, i filamenti di actina sono stati polimerizzati (8 µM, >30 min) in F-buffer. Una frazione di monomeri di actina è stata etichettata con Alexa-488 o 568. I filamenti sono stati infine iniettati nella camera e ancorati al coprioggetto dalle gelsoline fino alla densità desiderata.

Per misurare il tasso di depolimerizzazione delle estremità appuntite decorate con cofilina, i filamenti sono stati prima saturati con 2 µM di cofilina, ed esposti a 2 µM di cofilina integrata con diverse proteine CAP. Il tasso di depolimerizzazione è stato analizzato con ImageJ, facendo prima un chimografo per ogni filamento (funzione reslice) e adattando manualmente una pendenza lungo l’estremità a punta. Filamenti, che le estremità appuntite non poteva essere chiaramente tracciato o aveva possibili (non) osservato pause53 o eventi di separazione sono stati scartati dall’analisi.

Per ridurre al minimo l’effetto della proteina etichetta sulle nostre misure, abbiamo usato sia il 10% o 16% frazione etichettatura di actina a seconda della configurazione microscopia. Non abbiamo osservato effetti della frazione di etichettatura per l’attività N-CAP nei nostri esperimenti. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti a temperatura ambiente, in configurazione non controllata dalla temperatura.

Rianimazione dei filamenti di actina

Soluzioni di F-actina preformate e allo stato stazionario (in F-buffer) con diverse etichette fluorescenti sono state mescolate e incubate per quantificare la ricottura. La soluzione mista conteneva 4 µM di Alexa568-actina (etichettata al 10%) e 4 µM di Alexa488-actina (etichettata al 10%), con o senza N-CAP e mutanti. Dopo 4 min a temperatura ambiente, la soluzione mista di F-actina è stata diluita 100× in tampone integrato con 0,2% metilcellulosa, e fatto scorrere in una camera aperta fatta con nastro biadesivo inserito tra due coprioggetti, e passivato con BSA. Serie di immagini (intervallo di 2 s) sono state acquisite in almeno tre diversi campi di vista. Il numero di verde (Alexa488) segmenti di F-actina sono stati contati, così come il numero di questi segmenti che erano collegati a un rosso (Alexa568) segmento di F-actina, al fine di determinare il rapporto di due segmenti di colore tracciati in Fig. 2f. Il monitoraggio della diffusione dei filamenti ci ha permesso di determinare senza ambiguità quando due segmenti erano collegati. I controlli (senza N-CAP nella miscela di F-actina) sono stati ripetuti più volte, e gli esperimenti (con N-CAP o mutanti) almeno due volte.

Saggi di recisione dell’actina

Per studiare l’impatto di N-CAP sulla recisione da parte della cofilina, abbiamo usato due metodi diversi, sia (1) misurando la frazione di singoli domini di cofilina che non hanno ancora portato ad una recisione o (2) quantificando il numero globale di eventi di recisione per µm di filamento di actina.

(1) Recisione associata a singoli domini di cofilina (Fig. 3c supplementare). Abbiamo seguito la procedura descritta in precedenza16. Brevemente, all’interno di una camera microfluidica, 12% Alexa-488-etichettati filamenti di actina sono stati polimerizzati da spectrin-actin semi, ancorati non specificamente ad un BSA-passivato coprioggetti. I filamenti sono stati invecchiati per 15 minuti con una soluzione di G-actina a concentrazione critica (100 nM G-actina), in modo che i filamenti diventano >99% ADP46. I filamenti sono stati poi esposti continuamente a 500 nM di mCherry-cofilina-1 da solo, con 2 µM di CAP1 full-length o con 10 µM di N-CAP. Su ImageJ, sono state poi costruite chimografie dei filamenti per seguire la nucleazione e l’assemblaggio di singoli domini di cofilina e gli eventi di separazione all’interfaccia con i segmenti di actina nuda.

Per ogni dominio, il tempo 0 è stato definito al fotogramma in cui si sono nucleati. Abbiamo poi registrato il tempo in cui hanno indotto un evento di separazione, o quando sono stati persi a causa della separazione da un altro dominio, fusione, o evento di censura. La frazione di domini che non hanno indotto un evento di separazione è stata poi calcolata utilizzando un classico metodo Kaplan-Meier.

(2) Numero totale di eventi di separazione/µm (Fig. 3d supplementare). All’interno di camere di flusso (tra due vetrini distanziati da nastro biadesivo, abbiamo prima iniettato filamenti prepolimerizzati Alexa-488-etichettati (in F-buffer, con 0.2-0.3% Methylcellulose). La soluzione è stata poi scambiata con 500 nM di cofilina-1 non marcata e 0, 1 o 10 µM di NCAP. Dopo lo scambio, i filamenti rimasti vicino alla superficie sono stati analizzati come segue.

Il numero di eventi di taglio per µm è stato calcolato come funzione cumulativa

dove Nsev(u) è il numero di eventi di separazione al tempo u, e \(\mathop {sum}nolimits_i {l_{i(u)}}}) è la somma su tutti i filamenti i della loro lunghezza al tempo u. Poiché la soluzione non contiene G-actina, i filamenti si depolimerizzano, e la lunghezza dei filamenti diminuisce quindi nel tempo.

Il legame di N-CAP alle estremità appuntite dei filamenti

L’esperimento è stato eseguito in camere di flusso (vedi saggio di separazione dell’actina (2)), passivato con biotina-PLL-PEG e funzionalizzato con neutravidina. F-actina (10% Alexa-568, 1% biotina) è stato polimerizzato durante la notte a 4 µM. Appena prima dell’iniezione nella camera, la F-actina è stata diluita fino a 200 nM e mescolata con 100 nM N-CAP-GFP, 2 µM cofilina-1, e 4 nM proteina tappante, in F-buffer integrato con 0,2% metilcellulosa. Le immagini dei filamenti di actina sono state acquisite prima e dopo un’acquisizione del flusso del canale GFP (5 fotogrammi/secondo su 12 s, microscopia TIRF). Per l’analisi di legame alle estremità dei filamenti, filamenti di actina che non si muovevano durante l’acquisizione del flusso sono stati selezionati alla cieca. La fluorescenza è stata misurata sulle due estremità di ogni filamento, su un’area di 3 per 3 pixel. Un evento di legame è stato rilevato quando la fluorescenza andava oltre una soglia arbitraria (stesso valore per tutti i filamenti e le estremità dei filamenti). Poiché la proteina di tappatura dovrebbe proteggere l’estremità spinata, l’estremità appuntita è stata attribuita a quella con più eventi di legame. N-CAP-GFP è stato rilevato nel 17% dei punti dati all’estremità appuntita del filamento, mentre l’associazione aspecifica di N-CAP-GFP in prossimità dell’estremità spinata del filamento è stata rilevata nell’1,7% dei punti dati. La frazione di sopravvivenza di N-CAP all’estremità appuntita è stata poi calcolata e montata con un esponenziale singolo per misurare il tasso di unbinding.

Cristallizzazione e determinazione della struttura

Il dominio HFD del topo è stato cristallizzato con 10×His-tag presente, e purificato come descritto sopra, con l’eccezione di usare 5 mM HEPES, 50 mM NaCl, 0,2 mM DTT, 0,01% NaN3, pH 7,5 buffer in gel filtrazione. Il campione è stato concentrato a 7-10 mg / ml prima della cristallizzazione e mescolato 1:1 a 0,1 M sodio cacodilato, 12% PEG4000 (w / v), pH 6.1 in utilizzando un metodo di goccia seduta con dimensione goccia di 200 nl in formato 96 pozzetti. Dopo 2 settimane di incubazione sono stati osservati grandi cristalli aghiformi. Per la raccolta di dati a distanza al Diamond Light Source (UK, Didgot) a beamline I03 i cristalli sono stati crioprotetti immergendo in liquido madre contenente 25% glicerolo e snap-congelati in N2 per la spedizione al beamline. I dati sono stati raccolti a 100 K utilizzando una lunghezza d’onda di 0,9763 Å, un rivelatore Pilatus3 6M, una potenza di trasmissione del 30%, un’esposizione di 0,05 s e un angolo di oscillazione di 0,1° per un totale di 2400 fotogrammi. I dati di diffrazione sono stati integrati e scalati con X-ray Detector Software (XDS)54. La soluzione iniziale è stata ottenuta con sostituzione molecolare utilizzando PHASER55 e PDB = 1s0p come modello di ricerca. Una soluzione con quattro domini HFD presenti in un’unità asimmetrica è stato trovato, dopo di che cicli multipli di perfezionamento con BUSTER56 e costruzione manuale in COOT57 prodotto un buon adattamento ai dati (vedi Tabella 1). Ulteriori miglioramenti sono stati ottenuti raffinando i dati con l’introduzione di parametri di traslazione-liberazione-vite (1/catena), la rimozione di vincoli non cristallografici e la modellazione di singoli fattori B atomici. Il Rwork/Rfree finale per il modello era 18,6%/23,0% con una buona geometria generale.

Per la cristallizzazione del complesso tripartito (di ADP-actina, dominio HFD di mouse CAP1, e dominio ADF-H C-terminale di mouse twinfilin-1), ADP-actina è stato preparato in dialisi O/N a +4 °C in 5 mM HEPES, 0.2 mM MgCl2, 0,2 mM ADP, 0,2 mM EGTA, 0,3 mM glucosio, 0,5 mM β-mercaptoetanolo, pH 8,0. La soluzione di actina, contenente 0,3 mM glucosio e 5 U/ml di esochinasi, è stata trasferita su una membrana di dialisi Slide-A-Lyser e messa su un dispositivo galleggiante a +4 °C. Il giorno successivo prima della formazione del complesso, l’actina è stata centrifugata per 20 min a 355.040 × g con rotore TLA-120. Le proteine sono state mescolate in rapporto 1:1.1:1.1 (actina, dominio HFD, dominio ADF-H), concentrate a 10-20 mg/ml e utilizzate per la cristallizzazione come sopra. Hits sono stati ottenuti da diverse condizioni, e il miglior cristallo diffrangente è stato ottenuto a ~ 10 mg / ml di concentrazione del complesso mescolato 1:1 in 0,1 M HEPES, 0,1 mM KCl, 10% PEG4000 (w / v), pH 7.0 con dimensione della goccia seduta di 200 nl. Il primo giorno, diversi piccoli cristalli a forma di diamante sono apparsi nella goccia. Il terzo giorno, un grande cristallo a forma di asta è apparso mentre tutti i piccoli cristalli sono stati dissolti. Per la raccolta di dati a distanza al Diamond Light Source (UK, Didgot) alla beamline I03, i cristalli sono stati crioprotetti immergendoli in LV CryoOil (MiTeGen) e congelati in N2 per la spedizione. I dati sono stati raccolti a 100 K utilizzando una lunghezza d’onda di 0,9762 Å, un rivelatore Pilatus3 6M, una potenza di trasmissione del 20%, un’esposizione di 0,05 s e un angolo di oscillazione di 0,15° per un totale di 2400 fotogrammi. I dati di diffrazione sono stati integrati e scalati con XDS54. Una prima soluzione è stata ottenuta con la sostituzione molecolare utilizzando PHASER55 e PDB = 3daw come modello di ricerca che ha mostrato una chiara densità extra nell’estremità appuntita dell’actina monomero. Così un’altra sostituzione molecolare è stata effettuata, e un modello iniziale per il complesso tripartito è stato ottenuto usando BALBES58 con 3daw e 1s0p come modelli di ricerca. Questo ha prodotto una soluzione con Q = 0,787 e Rwork/Rfree = 29,7%/35,6%. L’unità asimmetrica conteneva un singolo complesso 1:1:1 di HFD:ADF-H:ADP-actin. Per migliorare il modello sono stati necessari più cicli di raffinamento con BUSTER56 e la costruzione manuale in COOT57, specialmente la ricostruzione del D-loop e dei loop di collegamento degli α-elici nel dominio HFD. Infine, l’aggiunta di acque, l’introduzione di parametri di traduzione-librazione-vite (1/catena), e la modellazione di singoli fattori atomici B hanno prodotto un modello con Rwork/Rfree finale del 16,6%/19,4% con una buona geometria generale.

Esame delle interazioni proteina-proteina per filtrazione su gel

Per studiare il legame dei monomeri di actina, ADP-G-actina è stato preparato come descritto in rif. 34. Tutti gli esperimenti di filtrazione su gel sono stati eseguiti a +4 ° C con 0,5 ml/min velocità di esecuzione e 0,5 ml di frazionamento con Superdex 200 aumento 10/300 GL colonna di filtrazione su gel equilibrato in 5 mM HEPES, 100 mM NaCl, 0,1 mM ADP, 0,1 mM MgCl2, 1 mM DTT, pH 7,4. Cento microlitri di complesso contenente 18 µM di dominio ADF-H di twinfilina, 15 µM di altre proteine sono stati iniettati nella colonna e analizzati per eluizione. Le frazioni di picco sono state analizzate anche tramite SDS-PAGE. Gli esperimenti di competizione dei monomeri di actina sono stati eseguiti come sopra, includendo 15 µM di dominio C-CAP o CARP ai campioni. Le frazioni di picco sono state analizzate su SDS-PAGE, i gel sono stati ripresi con il sistema di imaging ChemiDoc XRS + (Bio-Rad) e quantificati utilizzando Image Lab (Bio-Rad).

Native-PAGE

I gel Mini-Protean TGX 10% (Bio-Rad) sono stati pre-eseguiti in tampone raffreddato (25 mM Tris, 195 mM glicina, 0,5 mM ADP, 0,1 mM MgCl2, pH 8,5) per 1 ora prima del caricamento. I campioni sono stati preparati in tampone di dialisi ADP-actina (5 mM HEPES o Tris, 0,1 mM MgCl2, 0,1 mM EGTA, 0,2 mM ADP, 0,3 mM glucosio, 0,1 mM DTT, pH 8.0) alla concentrazione di 20 µM di ogni proteina, mescolata in rapporto 1:1 con il tampone di carico 2× (tampone di corsa contenente il 20% di glicerolo, blu di bromofenolo, senza ADP o MgCl2) e poi applicando un volume di 5 µl ai pozzetti del campione da 50 µl. I gel sono stati eseguiti a 100 V in ghiaccio per 4 ore.

Saggio fluorometrico di disassemblaggio dei filamenti di actina

Il disassemblaggio allo stato stazionario dei filamenti di ADP-actina è stato eseguito come segue: Il 5% di pirene-actina è stato polimerizzato in 20 mM HEPES, 100 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 1 mM ATP, 1 mM DTT, pH 7.4 per 60 minuti. Le estremità spinate dei filamenti sono state tappate da 50 nM di proteina tappante. Successivamente, sono stati aggiunti 0,5 µM di cofilina (e 0,5 µM di N-CAP) e la reazione è stata avviata aggiungendo 4 µM di proteina legante la vitamina D (agente sequestrante dei monomeri). La concentrazione finale di actina era di 2,5 µM. Lo smontaggio dell’actina è stato misurato seguendo la fluorescenza del pirene con eccitazione a 365 nm ed emissione a 407 nm sullo spettrofotometro a fluorescenza (Agilent) per 2400 s a 22 °C.

Spettrometria CD

Gli spettri CD per l’N-CAP wild type, i mutanti e il dominio HFD sono stati misurati a 20 °C con lo spettropolarimetro J-720 (Jasco), in cuvette di quarzo da 300 µl di lunghezza del percorso della luce di 0,1 cm con i seguenti parametri: modalità di scansione continua con velocità di scansione di 50 nm/min, larghezza di banda 0,5 nm, gamma di onde 190-260 nm, passo dati 0,5 nm. Tutte le proteine sono state diluite a 15 µM con tampone PBS al 10%. L’accumulo di dieci scansioni per ogni proteina è stato tracciato come una singola curva.

Modelli per simulazioni atomistiche MD

I modelli di actina decorata con cofilina sono stati basati sulla struttura della microscopia crioelettronica con risoluzione 3,8 Å (PDBID: 5YU8)41. I loop mancanti sono stati costruiti utilizzando RosettaCM59 e RosettaScripts60 in presenza della mappa di densità elettronica41 imponendo la simmetria elicoidale associata. Per abbinare i costrutti sperimentali in questo lavoro, le sequenze di actina e cofilina sono state, in questa fase, cambiate da quelle del pollo a quelle del coniglio e del topo, rispettivamente. Sono stati generati più di 1000 modelli. Sono stati, poi, ordinati in base al loro punteggio totale e quelli che contenevano artefatti strutturali (ad esempio, legami peptidici cis) sono stati filtrati. Dinamica molecolare (MD) simulazioni sono state avviate dal punteggio superiore tre modelli (Tabella supplementare 1, simulazioni F1-3).

Il complesso HFD-actina è stato isolato dal cristallizzato dominio HFD /actina /winfilin ADF-H complesso e separatamente docked sui modelli selezionati cofilina-decorato filamento di actina sopra descritto. A questo scopo, l’HFD-actina isolata è stata sovrapposta a ciascun monomero di actina a punta, che è stato poi sostituito con l’HFD-actina. In questo modo, la conformazione della struttura cristallina del dimero actina-HFD viene trasferita alla punta dell’actina decorata con cofilina. I modelli agganciati sono stati prima raffinato localmente utilizzando il protocollo docking 61 seguita da rilassamento trattenuto con il protocollo di relax veloce62 distribuito con il Rosetta Software Suite. Questo processo è stato applicato separatamente per ogni filamento di actina cofilina-decorato selezionato per le simulazioni MD (Tabella 1 supplementare, simulazioni C1-3).

Costruzione del segmento terminale appuntito per simulazioni MD

Ogni simulazione è stata eseguita su un segmento terminale appuntito del modello selezionato filamento di actina cofilina-decorato, che è stato creato affettando il modello perpendicolare all’asse del filamento. Il piano del taglio è stato scelto in modo che quattro interi monomeri di actina ADP-Mg2 + legato, e tre monomeri cofilina intero sono stati inclusi all’interno del segmento (Tabella 1 supplementare, simulazioni F1-3). Il segmento conteneva anche i due domini HFD all’estremità appuntita nei sistemi legati HFD (Tabella 1 supplementare, simulazioni C1-3). Il segmento a punta conteneva anche diversi frammenti polipeptidici di cofiline e actine alla sua estremità spinata (Fig. 5a supplementare). Per mantenere la loro conformazione e la loro posizione durante le simulazioni, queste catene spezzate sono state tenute ferme in posizione durante le simulazioni come segue: Uno strato di residui all’interfaccia con il resto del segmento terminale appuntito è stato lasciato libero; tutti gli atomi pesanti vicino al piano di taglio e solo gli atomi pesanti della spina dorsale per le regioni in mezzo sono stati trattenuti con una costante di forza di 100 kJ/mol/nm2 (Fig. 5a supplementare). Questi frammenti polipeptidici parzialmente trattenuti all’estremità spinata agiscono come una piattaforma durante le simulazioni. Questo approccio mantiene sia il filamento-come interfaccia proteina-proteina all’estremità spinata e l’orientamento del filamento durante le simulazioni.

Gli stati di protonazione dei residui sono stati determinati a pH neutro basato su calcoli pKa utilizzando PROPKA363. Ogni residuo H73 di actina è stato metilato (Nτ-Methyl-l-histidine, HIC), e gli N-termini di actina, cofilina e HFD sono stati acetilati. Le topologie per ogni molecola nei sistemi è stato preparato con il programma LeAP distribuito con ambertools1864, che sono stati poi convertiti in formato GROMACS utilizzando lo strumento ParmEd.

Ogni fetta terminale appuntito creato dai modelli selezionati è stato posto in una scatola di simulazione prisma esagonale con il suo asse lungo allineato con l’asse z. Le dimensioni della scatola sono state scelte per avere una distanza minima di circa 17 Å tra il filamento e ogni faccia della scatola (Tabella 1 supplementare). Ogni sistema è stato solvatato con 0,15 M NaCl soluzione con il numero di ioni regolati per neutralizzare il sistema.

Prima della produzione corre, minimizzazione steepest descent e successive simulazioni di equilibrio breve (in totale ~ 7 ns) nel NVT e NpT ensemble utilizzando il termostato Berendsen e barostat65 sono stati eseguiti. Vincoli posizionali armonici sono stati applicati alla fetta finale appuntita durante queste simulazioni di equilibrio. Un gruppo più piccolo di atomi (tutti gli atomi pesanti, la spina dorsale della proteina, e infine solo gli atomi Cα) sono stati trattenuti in ogni simulazione di equilibrio consecutivo con una costante di forza di 1000 kJ/mol/nm2.

I sistemi che sono stati ramificati dagli altri (Tabella supplementare 1; C1′, C2′. F2′) sono stati preparati apportando la modifica adatta (aggancio o rimozione dei domini HFD), rimuovendo le molecole di solvente sovrapposte (quando i domini HFD erano agganciati), e riadattando le dimensioni della scatola e gli atomi di solvente per le nuove dimensioni del sistema. Staged NVT e NpT equilibrio con vincoli sono stati eseguiti come sopra (in totale ~ 200 ps per le simulazioni in cui i domini HFD sono stati rimossi, e in totale ~ 4 ns dove è agganciato).

Tutte le corse di produzione sono stati eseguiti per 1-2.5 μs nell’ensemble NpT con solo i suddetti vincoli posizionali sulla regione della piattaforma.

Campi di forza e parametri nelle simulazioni MD

I seguenti campi di forza e set di parametri sono stati impiegati nelle simulazioni MD: Amber ff14sb66 per le proteine, il modello TIP3P67 per l’acqua, il set di parametri di ioni monovalenti di Joung e Cheatham68 per Na+ e Cl-, un modello di ioni ottaedrici multisito di Saxena e Sept69 per Mg2+, e un set di parametri di composti polifosforilati di Meagher et al.70 per ADP. Parametri mancanti legato per metil-istidina (Nτ-Methyl-l-istidina, HIC) sono stati adottati dal campo di forza GAFF264. Le cariche atomiche sono state calcolate seguendo il protocollo di Duan et al.71 R.E.D.III.5 software72 è stato impiegato per multiconformazione trattenuto potenziale elettrostatico (RESP) adattamento utilizzando un esteso e un α-elica conformazioni di HIC dipeptide (Ace-HIC-Nme). Tutti i calcoli chimico-quantistici sono stati eseguiti utilizzando il programma Gaussian09 suite73 al livello di teoria b3LYP/cc-pVTZ. I calcoli di carica sono stati eseguiti con il modello IEFPCM in un continuum polarizzabile con una costante dielettrica di 4 impostando il solvente come etere.

Protocolli di simulazione MD

Tutte le simulazioni sono state effettuate utilizzando GROMACS 2018 74. Le equazioni del moto sono state integrate utilizzando un algoritmo leap-frog con un passo temporale di 2 fs. Tutti i legami sono stati vincolati utilizzando l’algoritmo LINCS75. I protocolli di simulazione sono stati scelti secondo ref. 66. Interazioni elettrostatiche a lungo raggio sono stati trattati dal liscio schema Ewald mesh particelle76 con un cutoff spazio reale di 0,8 nm, una spaziatura di Fourier di 0,12 nm, e un quarto ordine interpolazione. Lennard-Jones potenziale con un cutoff di 0,8 nm è stato utilizzato per van der Waals interazioni. Correzioni di dispersione a lungo raggio sono state applicate per l’energia e la pressione77.

Tutte le simulazioni di produzione sono state eseguite nell’ensemble NpT. La fetta estremità appuntita, la piattaforma e solvente (acqua e 0,15 M NaCl) sono stati accoppiati a bagni di temperatura separati a 310 ° K utilizzando il termostato Nosé-Hoover78,79 con una costante di tempo di 1,0 ps. Accoppiamento isotropo pressione è stata eseguita utilizzando il Parrinello-Rahman barostat80 con una pressione di riferimento di 1 atm, una costante di tempo di 5 ps, e una compressibilità di 4,5 × 10-5 bar-1.

Analisi delle simulazioni MD

Tutte le analisi sono state effettuate utilizzando VMD81 e script in-house. I calcoli MMGBSA sono stati eseguiti utilizzando il software MMPBSA.py82 distribuito con ambertools1864 utilizzando il modello GB modificato sviluppato da Onufriev et al.83 con concentrazione di sale 0,15 M (frame campionati ogni 100 ns scartando i primi 500 ns di ogni simulazione).

Analisi strutturali

Per l’analisi delle diverse strutture di actina e dei loro stati conformazionali presentati in Fig. 1d, abbiamo seguito il protocollo di Tanaka et al41,84. utilizzando la struttura F-actin (PDB 6djo) come riferimento.

Analisi statistica e riproducibilità

I dati in Fig. 2d, 4b e 4d sono stati raggruppati da diversi esperimenti eseguiti in giorni diversi, rappresentando così i dati di diversi esperimenti indipendenti. Pannelli 2f, 2g, 2h e 3d presentare i dati analizzati da un singolo esperimento rappresentativo. n descrive il numero di filamenti analizzati per i pannelli 2d, 2f, 2g, 4b e 4d. n nel pannello 6c corrisponde al numero di volte l’esperimento è stato condotto.

Esperimenti in figure supplementari. 2a-d, 3c, 6a-d sono stati eseguiti con risultati simili almeno due volte. Gli esperimenti in 3d, l’esperimento di competizione del dominio CARP in 6a, e gli esperimenti in condizioni di promozione dell’assemblaggio in Fig. 7 sono stati condotti una volta.

Reporting summary

Ulteriori informazioni sul disegno della ricerca sono disponibili nel Nature Research Reporting Summary collegato a questo articolo.