La riduzione di RyR1 in vivo nel muscolo innesca una miopatia core-like

Generazione del modello di topo RyR1Flox/Flox::HSA-Cre-ERT2 modello di topo

Una linea di topo con siti loxP inseriti su entrambi i lati degli esoni 9-11 del gene RYR1 (così chiamato RyR1Flox/Flox) è stata accoppiata con la linea di topo HSA-Cre-ERT2 che esprime la ricombinasi Cre-ERT2 dipendente dal tamoxifene sotto il controllo del gene α-actina del muscolo scheletrico umano, per creare RyR1Flox/Flox::HSA-Cre-ERT2. L’iniezione di tamoxifene induce l’attivazione della ricombinasi Cre-ERT2 selettivamente nel muscolo scheletrico, che si traduce nella delezione degli esoni 9-11 e nella rottura del gene RYR1 nel muscolo scheletrico con una stretta dipendenza dal tamoxifene (Fig. 1a). Alla nascita, i topi RyR1Flox/Flox::HSA-Cre-ERT2 erano normali, e a 2 mesi di età, una volta giovani adulti, la ricombinazione è stata indotta da iniezione di tamoxifene (da questo momento, gli animali ricombinati sono stati chiamati RyR1-Rec). Le conseguenze molecolari e fisiologiche sono state ulteriormente studiate in funzione del tempo, fino a 105 giorni dopo l’induzione della ricombinazione (Fig. 1b). Gli animali di controllo (CTRL) sono cucciolate RyR1Flox/Flox (senza il transgene HSA-Cre-ERT2) iniettate con tamoxifene. Il fenotipo generale dei topi ricombinati a 75 giorni è caratterizzato da una cifosi associata a una mobilità anormale degli arti posteriori e una camminata ondeggiante. Gli animali sono ancora in grado di stare in piedi sulle loro zampe posteriori per nutrirsi, ma le palline di cibo erano state sistematicamente date direttamente nella gabbia man mano che la malattia progrediva. A 105 giorni, gli animali sono ancora mobili nelle loro gabbie e non è stato osservato un aumento del tasso di mortalità rispetto a CTRL. Sia i maschi che le femmine sono stati colpiti. La quantità relativa di RyR1 a livello di mRNA è stata analizzata nel muscolo quadricipite ogni 15 giorni dopo la ricombinazione usando RT-q-PCR in CTRL e negli animali RyR1-Rec (Fig. 1c). Un rapido calo di RyR1 mRNA è stato osservato, con un livello basso e stabile del 21% ± 4% del valore iniziale raggiunto già 3 giorni dopo l’iniezione di tamoxifene. Una riduzione è stata osservata in tutti i muscoli testati 75 giorni dopo l’induzione della ricombinazione (quadricipite, tibiale anteriore, EDL, soleo, file aggiuntivo 1: Fig. S1A). La quantità di proteina RyR1 è stata ulteriormente analizzata, utilizzando il Western blot quantitativo negli omogenati del muscolo quadricipite (Fig. 1d, e). Questa quantità è stata progressivamente ridotta e ha raggiunto circa il 50% del valore iniziale dopo 105 giorni. Nessuna ulteriore riduzione della proteina RyR1 è stata osservata su tempi più lunghi (dati non mostrati). La quantità di proteina RyR1 è stata quantificata in diversi omogenati muscolari 75 giorni dopo la ricombinazione. Una riduzione è stata osservata in tutti i muscoli testati, anche se la quantità rimanente leggermente diverso tra i muscoli, il più alto è in interosseo (64% ± 5%) e il più basso in soleus (33% ± 5%) (Additional file 1: Fig. S1B).

I topi RyR1-Rec mostrano una progressiva riduzione del peso muscolare e corporeo e della forza muscolare

Le conseguenze della riduzione di RyR1 sono state prima studiate a livello dell’intero animale. Inizialmente allo stesso peso, gli animali CTRL hanno lentamente guadagnato peso da 24,4 ± 0,4 a 30,6 ± 0,8 g a D90 mentre gli animali RyR1-Rec hanno progressivamente perso peso a 20,6 ± 1,3 g a D90 (Fig. 2a). Sia i maschi che le femmine sono stati colpiti e hanno perso circa il 13% del loro peso corporeo iniziale dopo 75 giorni (Additional file 1: Fig. S1C). Questo è il risultato di una perdita di peso osservata in tutti i muscoli (Additional file 1: Fig. S1D). Per testare le prestazioni muscolari complessive dopo la riduzione di RyR1, gli animali sono stati sottoposti a due diversi test di forza. Sono stati prima autorizzati ad appendere la presa di una superficie a filo incrociato con tutte e quattro le zampe fino a 5 min, la latenza di caduta che riflette la forza muscolare. Il test di presa eseguito ogni settimana per 105 giorni (Fig. 2b) ha mostrato che gli animali RyR1-Rec hanno iniziato a perdere forza 20-30 giorni dopo l’iniezione di tamoxifene, quando la quantità di RyR1 era circa il 75-80% del suo valore iniziale, ed erano incapaci di appendersi alla griglia circa 75 giorni dopo l’iniezione di tamoxifene, poiché la quantità di RyR1 aveva raggiunto il livello di circa il 60%. La forza muscolare è stata valutata anche da un protocollo di elettrostimolazione non invasiva di 6 minuti del muscolo gastrocnemio accoppiato alla risonanza magnetica anatomica (MRI) in anestesia generale. Durante il protocollo di elettrostimolazione degli animali CTRL 30 giorni dopo l’iniezione di tamoxifene (Fig. 2c, D30) è stato registrato un tipico profilo di esercizio, con una forza muscolare iniziale stabile che è lentamente diminuito come muscolo affaticato. Nel gruppo CTRL a D60 e D90 il profilo di esercizio ha mostrato un miglioramento della forza muscolare quando gli animali sono invecchiati (Fig. 2c). Al contrario, le prestazioni degli animali RyR1-Rec, simili a quelle di CTRL a D30, sono peggiorate con l’età. Gli animali RyR1-Rec non erano più in grado di eseguire l’esercizio a D90 (Fig. 2c, RyR1-Rec D90). Il volume del gastrocnemio misurato con immagini MR (Fig. 2d) è rimasto stabile negli animali CTRL da D30 (161 ± 5 mm3) a D90 (164 ± 4 mm3). Al contrario, nei topi RyR1-Rec, il volume del gastrocnemio era significativamente più piccolo che nei topi CTRL da D30 (141 ± 3 mm3, p = 0.003), ed è stato ulteriormente ridotto fino a 100 ± 3 mm3 a D60 (p < 0.001 rispetto a CTRL alla stessa età) e 69 ± 4 mm3 a D90 (p < 0.001 rispetto a CTRL alla stessa età). La tensione di contrazione massima specifica (tensione di contrazione assoluta normalizzata al volume muscolare) conferma che entrambi i gruppi hanno presentato una forza muscolare simile a D30 (Fig. 2e), ma la forza degli animali RyR1-Rec è diminuita drasticamente mentre è aumentata negli animali CTRL con l’età. Inoltre, i cambiamenti nella bioenergetica del muscolo gastrocnemio durante l’elettrostimolazione sono stati valutati non invasivamente a D60 utilizzando in vivo 31-fosforo (31P) spettroscopia MR. Mentre il pH intramiofibrillare basale non differiva tra i due gruppi (Additional file 1: Fig. S2A), l’entità dell’acidosi alla fine dell’esercizio era inferiore (p = 0,016) negli animali RyR1 Rec (Additional file 1: Fig. S2B), suggerendo così che il flusso glicolitico nel muscolo in esercizio era ridotto in questi animali. Inoltre, la costante di tempo della risintesi di fosfocreatina post-esercizio (τPCr) era significativamente più breve (p = 0,047) nei topi RyR1-Rec (Additional file 1: Fig. S2C, D), riflettendo una migliore funzione mitocondriale in vivo. Infatti, la sintesi PCr durante il periodo di recupero post-esercizio si basa esclusivamente sulla sintesi ossidativa di ATP, quindi τPCr è considerato come un indice della capacità di fosforilazione ossidativa. Nel complesso, questi risultati indicano che la riduzione progressiva di RyR1 è associata a una progressiva perdita di peso e un calo della forza muscolare.

Le proprietà fisiologiche delle fibre isolate sono compromesse nei topi RyR1-Rec

L’alterazione della funzione muscolare è stata ulteriormente caratterizzata a livello di singola fibra muscolare utilizzando una combinazione di whole-cell voltage-clamp e imaging confocale. La rete di T-tubuli è stata visualizzata colorando la membrana plasmatica con di-8-anepps. Nessuna differenza qualitativa nella rete (Fig. 3a, a sinistra) o differenza quantitativa nella densità media T-tubulo tra CTRL e RyR1-Rec fibre sono state osservate, accanto a un leggero ma significativo accorciamento della lunghezza media sarcomero a riposo (Fig. 3a, grafici a destra). L’afflusso di Ca2+ attivato dal voltaggio attraverso il DHPR (Fig. 3b-d) e il flusso di rilascio di Ca2+ attraverso RyR1 (Fig. 3e-i) sono stati valutati contemporaneamente. Rispetto alle fibre CTRL, RyR1-Rec fibre esibito voltaggio attivato DHPR Ca2 + correnti di tempo simile (Fig. 3b), ma la densità ridotta, come mostrato dal picco di densità di corrente vs tensione nei due gruppi (Fig. 3c), che ha tradotto in una riduzione del 30% della conduttanza massima (Gmax) senza alcun cambiamento associato negli altri parametri della corrente vs rapporto di tensione (Fig. 3d). La dipendenza dalla tensione del rilascio di SR Ca2 + è stato valutato da linea di scansione di imaging del Ca2 + sensibile rhod-2 colorante. Line-scan immagini dalle fibre RyR1-Rec erano qualitativamente simili a quelle delle fibre CTRL (Fig. 3e), mostrando un rapido aumento della fluorescenza su T-tubulo depolarizzazione della membrana, spazialmente omogenea lungo la linea di scansione. Il tasso di rilascio SR Ca2 + (Fig. 3g), calcolato dai cambiamenti in Rhod-2 fluorescenza suscitato da impulsi depolarizzanti di ampiezza crescente (Fig. 3f), ha mostrato un corso di tempo simile in RyR1-Rec fibra come in fibre CTRL, ma soprattutto, i valori di picco sono stati ridotti in RyR1-Rec. L’adattamento del tasso di picco del rilascio di Ca2+ SR rispetto alla tensione (Fig. 3h-alto grafico) ha indicato che il tasso massimo di rilascio di Ca2+ era ridotto del 25% nel gruppo RyR1-Rec (Fig. 3i, Max), il fattore di pendenza (k) era anche leggermente ma significativamente ridotto, mentre la tensione di media attivazione (V0.5) era invariata. Un leggero (1,3 ms in media) ma significativo aumento del time-to-peak rate del rilascio di SR Ca2+ nelle fibre RyR1-Rec (Fig. 3h, grafico inferiore) è stato osservato. Nessuna modifica è stata osservata nelle capacità di rimozione del Ca2+ citosolico delle fibre (funzione di pompa SERCA), misurata con il colorante a bassa affinità sensibile al Ca2+ fluo-4 FF in condizioni di non-EGTA-buffering (Additional file 1: Fig. S3). Nel complesso, questi risultati dimostrano che la riduzione del 35% della quantità di RyR1 nell’interosseo è associata a una riduzione del 30% della corrente di calcio attraverso il DHPR e una riduzione del 25% del flusso di calcio attraverso RyR1.

La riduzione di RyR1 influenza la struttura del muscolo scheletrico

Per comprendere meglio la base di queste alterazioni funzionali associate a una diminuzione di RyR1, la struttura muscolare è stata studiata su animali RyR1-Rec a D75 dopo la ricombinazione, e confrontata con animali CTRL. L’extensor digitorum longus (EDL), un muscolo a contrazione rapida, il soleo, un muscolo a contrazione lenta e il tibiale anteriore (TA), un muscolo misto, sono stati analizzati utilizzando le colorazioni ematossilina-eosina, NADH e tricromia di Gomori. Le colorazioni del TA, presentate in Fig. 4a, mostrano una struttura muscolare anormale negli animali RyR1-Rec, senza fibrosi o nuclei centrali, ma con atrofia delle fibre, che colpisce sia le fibre di tipo I che di tipo II (Tabella 2). Una disorganizzazione mitocondri caratterizzata da accumulo locale / deplezione in regioni adiacenti della stessa fibra (punta di freccia e inset Fig. 4a) e accumulo di colorazione rossa osservata con tricromia Gomori (file aggiuntivo 1: Fig. S4) è stato anche osservato, assomigliando ai nuclei polverosi recentemente descritti nei pazienti . L’atrofia delle fibre è stata osservata in entrambi i tipi di fibre in EDL, anche se la riduzione era leggermente più importante nelle fibre di tipo I (Tabella 2). Sezione trasversale TA di CTRL e RyR1-Rec topi sono stati colorati con anticorpi contro RyR1 e desmina. Nessuna modifica è stata osservata nella distribuzione RyR1 tra le fibre di tipo I e di tipo II in RyR1-Rec sezioni TA, indicando una riduzione RyR1 simile in tutti i tipi di fibre (Fig. 4b). Sorprendentemente, una modifica importante è stata osservata nella distribuzione desmina, con un enorme aumento nelle piccole fibre di tipo I (Fig. 4b): in sezioni CTRL TA, tutte le fibre presentato una colorazione periferica simile, mentre le piccole fibre di tipo I in RyR1-Rec sezioni TA erano pesantemente macchiato sia alla periferia della fibra e nel citosol (inset Fig. 4b). Anche se l’etichettatura IF non è quantitativa, questi risultati mostrano che la riduzione di RyR1 era molto probabilmente omogenea, senza alcuna differenza enorme tra le fibre adiacenti come osservato per la desmina, la quantificazione eseguita dal Western blot essendo il riflesso della proteina contenuta in ogni fibra e non una media di fibre con 0% RyR1 e fibre con 100% RyR1 all’interno dello stesso muscolo.

L’organizzazione delle triadi è stata ulteriormente studiata usando la marcatura immunofluorescente delle fibre EDL isolate (Fig. 5a). L’etichettatura dell’alfa-actinina (come marcatore della linea Z), della triadina e di RyR1 (come marcatori di triade) sulla fibra EDL RyR1-Rec ha dimostrato che la riduzione della quantità di RyR1 ha portato ad una disorganizzazione generalizzata della fibra con localizzazione anormale delle triadi e interruzione della linea Z, ma la triadina e RyR1 erano ancora parzialmente colocalizzate. Anche se le triadi sono rimaste su entrambi i lati della linea Z, la linea Z non ha formato una linea retta come in CTRL e invece ha presentato molte micro-disruzioni (inset Fig. 5a). L’ultrastruttura muscolare è stata analizzata utilizzando la microscopia elettronica sulle fibre RyR1-Rec EDL a D75 (Fig. 5b). Alcune regioni avevano una struttura relativamente conservato (Fig. 5b, fibra sinistra), mentre alcune regioni adiacenti erano altamente disorganizzato, con interruzione di organizzazione regolare sarcomero, mitocondri disorganizzazione, e la presenza di numerose pile di membrana (Fig. 5b, frecce, ingrandito in inset), precedentemente chiamato triadi multiple. Le caratteristiche morfologiche di queste triadi multiple rispetto alle normali triadi singole sono presentate nella tabella 3, e ulteriori esempi sono presentati nel file aggiuntivo 1: Fig. S5. Precisa quantificazione della larghezza putativa T-tubulo, larghezza putativa SR e intermembrana (T-tubulo/SR) spazio (Additional file 1: Fig. S5) ha dimostrato un enorme aumento della dimensione media T-tubulo in quelle triadi multipli (aumento di due volte, raggiungendo 202% della dimensione T-tubulo in triade normale), mentre la larghezza media SR era solo leggermente aumentato (+ 10%) e lo spazio intermembrana non è stato modificato. Questi risultati indicano una disorganizzazione strutturale generalizzata dei muscoli dei topi RyR1-Rec associata al rimodellamento delle membrane.

La riduzione di RyR1 è associata alla modifica della quantità di numerose proteine

Le conseguenze della riduzione di RyR1 sono state studiate a livello molecolare usando il Western blot quantitativo sul muscolo quadricipite di topi CTRL o RyR1-Rec (8 animali in ogni gruppo) a D75 dopo l’iniezione di tamoxifene (Fig. 6). La quantità relativa di numerose proteine coinvolte direttamente o indirettamente nella manipolazione del calcio è stata stimata, utilizzando come riferimento la quantità totale di proteine determinata dalla valutazione senza macchia. Nessuna differenza nella quantificazione di RyR1 è stata osservata tra questo metodo e l’uso della catena pesante della miosina come proteina di riferimento (confronto tra le Figg. 1, 6). Nessuna modifica significativa tra i muscoli CRTL e RyR1-Rec è stata osservata nella quantità della isoforma triadina T95, la proteina legante il calcio CSQ1, la Ca2+-ATPasi SERCA, la FoF1-ATPasi mitocondriale, e la subunità alfa 1 del DHPR (Fig. 6a, b). Al contrario, un aumento è stato osservato nella quantità di STIM1 (× 3.7 ± 1, p = 0.02), la triadina isoforma T51 (× 1.6 ± 0.1, p < 0.001), CLIMP63 (× 1.8 ± 0.2, p = 0.004), e ORAI1 (× 3.7 ± 1, p = 0.017). Come modifica nella localizzazione della proteina strutturale desmina è stato osservato utilizzando l’etichettatura immunofluorescente (Fig. 5b), il livello di espressione desmina è stato anche quantificato e un enorme aumento della quantità di desmina è stato osservato (× 8,2 ± 1,2, p = 0,001). La localizzazione di CLIMP63 e STIM1 nelle fibre EDL RyR1-Rec è stata analizzata utilizzando l’etichettatura immunofluorescente, e nessuna modifica importante è stata osservata (file aggiuntivo 1: Fig. S6). Pertanto la riduzione della proteina RyR1 era associata ad un aumento di diverse proteine coinvolte nella regolazione del calcio o nell’architettura muscolare.

L’autofagia è alterata come risultato della riduzione di RyR1

L’alterazione dell’autofagia è stata osservata in alcune miopatie. Al fine di identificare i meccanismi che portano all’atrofia muscolare conseguente alla riduzione di RyR1, abbiamo cercato modifiche nel flusso di autofagia nei muscoli RyR1-Rec. La quantità di LC3 II, una proteina di membrana degli autofagosomi, è stata valutata con Western blot quantitativo (Fig. 7a, b), e un aumento di LC3 II è stato osservato (172% ± 32%, p = 0,03). Questo aumento degli autofagosomi potrebbe riflettere sia un aumento della formazione di autofagosomi (a causa di un aumento del processo di autofagia) o una diminuzione della loro fusione con i lisosomi (e quindi un’inibizione della degradazione autofagica). La natura precisa della modifica del flusso di autofagia è stata ulteriormente analizzata attraverso la quantificazione di p62, una nota proteina specificamente degradata attraverso l’autofagia, la cui quantità è stata anche significativamente aumentata (Fig. 7a, b, 172% ± 22%, p = 0,006). L’aumento associato di LC3 II e di p62 nel muscolo RyR1-Rec rispetto al controllo ha suggerito che la riduzione di RyR1 era quindi associata all’inibizione del flusso di autofagia. Inoltre, è stato osservato un aumento dell’attivazione (fosforilazione) di due inibitori dell’autofagia, mTOR e proteina S6 (Fig. 7b, c), (P-mTOR/mTOR aumento del 174% ± 17%, p = 0,01; P-S6/S6 aumento del 320% ± 50%, p < 0,001). L’aumento della fosforilazione di questi due inibitori dell’autofagia negli animali RyR1-Rec rispetto ai controlli ha ulteriormente indicato un’inibizione dell’autofagia responsabile dell’atrofia muscolare negli animali RyR1-Rec.

Le biopsie dei pazienti umani mostrano difetti simili a quelli osservati nei topi RyR1-Rec

In un recente studio su una vasta coorte di pazienti con una miopatia congenita recessiva, abbiamo identificato la presenza di strutture atipiche, chiamate “dusty core”, in più della metà dei pazienti con una riduzione della quantità di RyR1. Essi sono stati osservati con colorazioni multiple e differiscono dal classico nucleo centrale (regioni ben definite prive di macchie ossidative) per i loro confini poco definiti, la loro disorganizzazione miofibrillare focale, un deposito di materiale granulare rosso-violaceo alla colorazione tricromica di Gomori e un’area mista con attività enzimatica diminuita o/e aumentata alle macchie ossidative (file aggiuntivo 1: Fig. S7). Queste alterazioni strutturali rispecchiano le modifiche osservate nel nostro modello di topo (Fig. 4 e Additional file 1: Fig. S7). Abbiamo quindi ulteriormente confrontato il nostro nuovo modello di topo e le biopsie muscolari di pazienti con una riduzione della proteina RyR1 e “nuclei polverosi”. Usando il Western blot quantitativo, la quantità delle proteine che erano chiaramente modificate nel nostro modello di topo è stata stimata anche in 5 pazienti con una malattia recessiva Dusty Core (due mutazioni RyR1 con conseguente riduzione della proteina RyR1 – Fig. 8a). Biopsie di controllo di età diversa (tra 3,5 e 64 anni) sono state utilizzate come riferimento. Una grande riduzione della proteina RyR1 è stata osservata in tutti i pazienti (livello medio di espressione 19,8% ± 2,2% di CTRL, p < 0,001). Inoltre, è stato osservato anche un aumento di CLIMP63 e desmina. La riduzione di RyR1 è stata associata a un importante aumento di CLIMP 63 (aumento medio del livello di espressione di cinque volte, 516% ± 220%). Inoltre, il livello di espressione di desmina era anche drasticamente aumentato nei pazienti rispetto al controllo (aumento medio del livello di espressione 240 volte, 24 170% ± 7 635%). Utilizzando la microscopia elettronica per analizzare l’ultrastruttura della biopsia del paziente, molte pile di membrane sono state osservate nelle regioni disorganizzate (Fig. 8c, frecce) di tutti i pazienti. Queste regioni, simili alle pile osservate nel muscolo RyR1-Rec (Fig. 4b), indicavano un meccanismo comune, sia nei topi che nell’uomo, che porta alla formazione di queste strutture come risultato della riduzione di RyR1. Con modifiche identiche a quelle dei pazienti affetti da Dusty Core Disease, questo modello costituisce quindi un modello rilevante per studiare i meccanismi fisiopatologici.