Contenuto e proprietà del fluido intracellulare

Questo capitolo è vagamente rilevante per la sezione E(iv) del CICM Primary Syllabus 2017, che prevede che il candidato all’esame “descriva la composizione …del fluido intracellulare”. Poiché questa è la sezione sulla fisiologia cellulare, l’attenzione qui sarà principalmente sul micro livello di organizzazione, e tutte le discussioni sul comparto dei fluidi corporei intracellulari saranno lasciate per la sezione Fluidi corporei.

Il fatto che gli esaminatori universitari non abbiano mai focalizzato il loro occhio su questo argomento conferisce un’aria quasi liberatoria di inutilità alla discussione su di esso, poiché sia i candidati all’esame che l’autore sono piacevolmente consapevoli che ognuno sta sprecando il tempo dell’altro. Piuttosto che immergersi nella scienza dura e memorizzare fatti esaminabili qui, si può facilmente continuare a leggere per ragioni di puro divertimento medico, o saltare avanti ad argomenti che attirano più voti.

In sintesi:

Quali sono le risorse peer-reviewed valide per questo argomento? Purtroppo sono numerose. Quando si usa un motore di ricerca o la sezione indice di un libro di testo per cercare “fluido intracellulare”, c’è inevitabilmente una risposta, una serie di voci o pagine o diapositive powerpoint che – sebbene tutte vagamente simili nel loro contenuto – differiscono nei loro valori citati, e non offrono nulla in termini di riferimenti. Molti non offrono alcuna informazione utile. Per esempio, nei libri ufficiali del college su questo argomento (Ganong, pag. 2 della 23esima edizione, e Guyton & Hall, pag. 4 della 13esima edizione), si trovano concentrazioni di elettroliti citosolici che vengono discusse con termini come “grandi quantità”. Anche al di fuori della bibliografia ufficiale, offerte altrimenti solide come Molecular Biology of the Cell non hanno risposte chiare. Non riescono nemmeno a mettersi d’accordo su come chiamarlo (citosol? Protoplasma? Primordialschlauch?)

Per fortuna, ci sono ancora scienziati che pubblicano su questo argomento. Probabilmente il miglior articolo è quello del 1999 di Katherine Luby-Phelps, che contiene fondamentalmente tutto ciò di cui potreste aver bisogno per rispondere a qualsiasi ipotetico futuro SAQ su questo argomento. Un’altra voce eccellente che tratta principalmente le proprietà del materiale intracellulare è il breve articolo di Richard P. Sear (2005). Se uno è veramente pazzo e ha le risorse di tempo di uno specialista con contratto permanente (cioè nessun obbligo urgente di svolgere effettivamente un lavoro utile) può invece esplorare In Search of the Physical Basis of Life (1984) di Gilbert Ling, un libro di 800 pagine scritto da un uomo le cui pubblicazioni sulla fisiologia cellulare risalgono agli anni ’50.

Volume di uno spazio intracellulare

Quanto è grande una cellula? Ovviamente, questo dipende dalla cellula. Un buon esempio di un outlier è l’ovocita di Xenopus, l’uovo di un rospo africano artigliato che ha un diametro di 1 mm. Quando si parla di esseri umani, di solito ci si riferisce al fluido intracellulare come se fosse un secchio relativamente omogeneo, ma in realtà quel compartimento fluido è composto da qualcosa come 1014 minuscoli compartimenti, ognuno dei quali ha un volume e una composizione leggermente diversi.

L’eterogeneità di tutti questi volumi è ben riassunta in questo capitolo del database BioNumbers, dove si possono trovare tutti i tipi di informazioni con riferimenti meticolosi. Viene qui riprodotto con minime modifiche, nel caso in cui i server di Harvard dovessero mai bloccarsi.

Volumi di cellule di mammiferi

Tipo di cellule	Volume (μm3, o femtolitri)	Volume (picolitri)	Riferimento
Cella spermatica	30	0.03	Gilmore et al, 1995
Eritrociti	100	0.1	Ballas et al, 1987
Linfociti	130	0.13	Schmid-Schonbein et al, 1980
Neutrofili	300	0.3	Rosengren et al, 1994
Cellule β pancreatiche	1.000	1.0	Finegood et al, 1995
Enterocita	1.400	1.4	Wiśniewski et al, 2012
Fibroblasto	2.000	2.0	Mitsui et al, 1976
Tumore cervicale (HeLa)	3.000	3.0	Zhao et al, 2008
Cellule di capelli (orecchio)	4.000	4.0	Géléoc et al, 1999
Osteoblasto	4.000	4.0	Beck et al, 2011
Macrofago alveolare	5.000	5.0	Krombach et al, 1997
Cardiomiocita	15.000	15.0	Calvillo et al, 2003
Megacariocita	30.000	30.0	Harker et al, 2000
Adipocita	60,000	60.0	Livingston et al, 1984
Oocita	4.000.000	4000	Goyanes et al, 1990

Quindi, è una gamma abbastanza ampia. Inoltre, ovviamente non tutto il contenuto della cellula sarà occupato dal “fluido intracellulare”, indipendentemente dalla vostra definizione di questo termine. Per esempio, ai fini di questo capitolo, la definizione di fluido intracellulare sarà “contenuti intracellulari che non sono organelli”, semplicemente perché gli organelli sono discussi in un altro capitolo. Ciò di cui stiamo parlando, in questo caso, è la “sostanza grigiastra, viscosa, viscida, semitrasparente e semifluida” che occupa lo spazio intracellulare tra le altre strutture (Harvey, 1937).

A seconda del tipo di cellula che si osserva, questo spazio potrebbe essere una proporzione molto piccola del volume totale. Per esempio, nell’adipocita omentale abozzato, di quei 60 picolitri di volume totale, la maggior parte sarà occupata da grasso senza acqua. Questo può essere dimostrato sperimentalmente: DiGirolamo & Owens (1976) ha potuto calcolare che il volume dell’acqua negli adipociti di ratto era circa il 5-7% del volume totale, cioè 1,5-2 picolitri.

In breve, stiamo guardando un volume molto piccolo. Perché questo è importante? Beh. Il volume liquido interno della cellula di 1-2 picolitri è il volume di distribuzione delle sostanze solubili. Le molecole di queste sostanze, quindi, hanno una distanza molto breve da percorrere prima di incontrarsi. L’effetto è quello di aumentare la velocità delle reazioni, il che è utile perché la quantità totale di molecole reagenti per un volume così piccolo è per forza di cose piccola. Per prendere in prestito un esempio da Luby-Phelps (2000), se una cellula ha un contenuto totale di 1 nanomole di una proteina, ciò significa che ci sono solo 1000 copie di quella proteina presenti nella cellula. Fortunatamente, con un volume così piccolo da attraversare, una molecola legante con un’affinità anche bassa sarebbe in grado di pulire e assorbire la maggior parte del substrato disponibile.

Contenuto proteico del fluido intracellulare

Ok, quindi il volume è piccolo. Quali macromolecole ci sono dentro, e quante sono? Alice B. Fulton (1982) ha pesato su questo con probabilmente la risposta più lucida nella letteratura pubblicata. Fondamentalmente, il contenuto proteico delle cellule è compreso tra il 17 e il 35% in peso, con la maggior parte degli autori che si attestano su un valore di 20-30g/100ml. Fulton cita testi antichi (Loewy et al, 1969) per dare i seguenti valori:

• Cellule muscolari: 23% di proteine in peso
• Eritrociti: 35% di proteine in peso
• Maggior parte delle altre cellule: dal 17% al 26% di proteine in peso

Le misurazioni sono di solito effettuate tramite misurazioni dell’indice di rifrazione che è una tecnica che di solito non discrimina tra le proteine strutturali (ad esempio quelle di cui sono composti il citoscheletro e gli organelli) e le proteine solubili che costituiscono il resto del goo.

Quindi, qual è lo scopo di questa discussione? Beh. Questa concentrazione di proteine è piuttosto alta. E’ al di sopra della concentrazione solitamente accettata di grandi polimeri che dovrebbe influenzare la diffusione di altri polimeri simili, cioè la foresta è troppo densa. Chang et al (1987) hanno prodotto un modello matematico che prevede che per i polimeri 50kDa e oltre, il limite di diffusione è di circa 130g/L, cioè più di questo e altri polimeri non saranno in grado di diffondere facilmente attraverso la soluzione. Certo, stavano usando polistirene sciolto in benzene, ma il fatto rimane. Per confronto, quando si cristallizza completamente una proteina, si finisce con un “solido” che è solo il 40% di proteine in peso

In sintesi, le proteine nel fluido intracellulare sono impacchettate così strettamente che il citosol deve essere descritto come una “soluzione affollata”. Il diagramma fumettistico qui (originariamente pubblicato da Goodsell nel 1993, e successivamente riprodotto da praticamente chiunque abbia mai scritto sul citosol) dimostra visivamente esattamente quanto strettamente impacchettati siano quei corpi. Il disegno è stato approssimato, usando dimensioni e forme note di molecole/microscopio elettronico, ma le immagini prese attraverso il SEM (per esempio da Bridgman & Reese, 1984) dimostrano che rappresenta correttamente la microstruttura disordinata del citosol. Guardando gli ovociti di Xenopus ad un ingrandimento di ~ 80.000, una fitta foresta di filamenti e granuli diventa evidente. L’immagine qui (una parte della loro figura 6) è stata effettivamente ripulita un po’ dalla lisi cellulare e dal lavaggio con detergente, per rimuovere parte del carico proteico che altrimenti oscurava la struttura più fine. Le frecce puntano alle giunzioni Y e T dei filamenti.

Senza la preparazione del detergente, tutto il materiale granulare fine imballato tra questi filamenti diventa visibile. L’immagine ora assomiglia al rumore bianco (stessi autori).

E’ chiaro che la diffusione attraverso questo boschetto non sarà normale. I soluti più piccoli (per esempio i vostri ioni di sodio e potassio) devono navigare intorno a questi enormi ostacoli, prendendo la strada panoramica verso l’altro. Da un punto di vista pratico, questo dovrebbe significare che qualsiasi reazione che dipende dalla velocità di diffusione sarà più lenta. Se le molecole impiegano un’eternità per raggiungere l’altra, sicuramente il tasso netto della loro interazione dovrebbe essere ridotto. Tuttavia, non lo vediamo.

Quali proprietà chimiche vediamo, con questa zuppa proteica altamente satura? Allen P. Minton (2006) ha riassunto anni di ricerca (principalmente la sua) in una tabella del documento di cui sopra. È riassunta qui:

• Aumento dell’affinità di legame di macromolecole altrimenti diluite tra loro
• Accelerazione delle associazioni proteiche, ad es. auto-assemblaggio
• Decelerazione delle reazioni limitate dalla diffusione e delle associazioni proteiche
• Stabilizzazione delle proteine contro la denaturazione termica

In sintesi, l’affollamento costringe le proteine a piegarsi e interagire, il che produce configurazioni complesse che sarebbero altrimenti impossibili in una soluzione diluita. Per esempio, Wilf & Minton nel 1981 ha scoperto che le molecole di mioglobina diluite in soluzione hanno poco interesse l’una nell’altra, ma l’aggiunta di una soluzione al 10% di (qualsiasi!) altra proteina fa sì che la mioglobina si assembli spontaneamente in dimeri.

Proprietà dell’acqua intracellulare

Anche in una proteina cristallizzata, solo il 40% della massa è proteina effettiva. Il resto è solvente che occupa gli spazi tra le molecole proteiche impacchettate (non sono esattamente rettangoli e non si impilano perfettamente). Quando il solvente è acqua, la metà di essa finisce per essere adsorbita sulla superficie della proteina, ma il resto può ancora essere visto come normale acqua liquida. In questo film sottile, gli ioni dell’acqua intracellulare sono dissolti.

Chiaramente, con l’acqua adsorbita legata, le cose sono leggermente diverse. Per esempio, le proprietà solventi di quest’acqua non saranno esattamente le stesse di quelle dell’acqua “libera”. Per esempio, avrà probabilmente un’attività chimica ridotta. Come ci si potrebbe aspettare, lo stato “ordinato” dell’acqua le dà diverse proprietà colligative insolite – per esempio, Foster et al (1976) hanno trovato che il suo punto di congelamento è depresso. Inoltre, ci saranno sacche di citosol con attività aumentata (intorno alle strutture proteiche idrofile) e diminuita (intorno a quelle idrofobiche).

Quanta parte dell’acqua è tenuta in questo stato prigioniero dalle proteine? Questo è un po’ difficile da dire. Gli esperimenti di Ling et al (1993) suggeriscono che all’interno delle cellule, la maggior parte dell’acqua è “ordinata” in questo modo, ma la maggior parte degli esperimenti che riportano questo argomento sono in qualche modo influenzati dal fatto che le cellule vive grezze che stanno usando hanno varie risposte omeostatiche alle condizioni sperimentali che confondono i risultati.

In genere, la gente cerca di stabilire questa risposta disidratando osmoticamente le cellule. Applicando una pressione osmotica, si ragiona, e tutta l’acqua “mobile” dovrebbe uscire dalla cellula. Poi si misura il contenuto d’acqua della cellula, e tutto ciò che rimane deve essere “immobile”, parcheggiato sulla superficie delle molecole proteiche e incapace di migrare in risposta alla pressione osmotica. Cameron et al (1997) presentano il grafico (rubato senza vergogna e mostrato qui, a sinistra) dove il contenuto di acqua delle cellule rimanenti è tracciato contro un asse x di pressione osmotica crescente. La linea della pressione contro l’acqua rimanente, quando estrapolata dall’evidenza sperimentale ed estesa verso una pressione osmotica “infinita”, finiva per attraversare l’asse y in qualche punto non nullo. A seconda delle cellule che si utilizzavano, si finiva per essere da qualche parte tra il 30-90% del contenuto totale di acqua.

In effetti, sembra che quest’acqua adsorbita sulle proteine sia l’acqua essenziale nelle cellule, e che tutta l’acqua “libera” sia una zavorra inutile. Clegg (1981), reidratando alcune cellule essiccate di gamberi in salamoia, ha scoperto che l’attività metabolica riprendeva ed era relativamente normale quando le cellule venivano ripristinate con circa il 35% di acqua in peso. cioè circa quanto ci si aspetta per “idratare” tutte le macromolecole. In quei gamberi, quasi certamente non era presente acqua libera in “fase bulk”. Certo, non stavano cercando di riprodursi o di sintetizzare l’RNA (che richiedeva un’idratazione fino al 70-80%) ma la loro sintesi di aminoacidi e lo scambio di gas avvenivano in modo relativamente normale. Ciò rende ancora più degno di nota il fatto che, misurato oggettivamente, questo denso brodo proteico al 20-30% ha una viscosità che assomiglia molto all’acqua normale (Luby-Phelps, 1994)

Fluido intracellulare pH

Carter (1972) ha pubblicato un articolo molto influente su questo, che è spesso citato nei libri di testo di fisiologia umana, anche se l’autore ha usato muscoli del cirripede gigante (Balanus nubilus) che ha sospeso in qualcosa chiamato “soluzione di Ringer del cirripede”, una salamoia con 450 mmol/L di sodio e 518 mmol/L di cloruro. Difficilmente si può continuare a leggere con un minimo di rispetto per la generalizzabilità umana di tali dati, ma se lo si facesse si scoprirebbe la scoperta più importante: che il pH nelle cellule è compartimentato a tal punto che diverse regioni del citosol avevano valori di pH selvaggiamente diversi, in un intervallo da 6,0 a 7,5.

Concentrazioni di elettroliti intracellulari

Generalmente, tutti i libri di testo, quando si chiede la concentrazione di elettroliti nel fluido intracellulare, produrranno un Gamblegramma come questo (tratto da Ling, 1984, senza il permesso della sua proprietà o del suo editore).

Questo diagramma non è citato nel libro di Ling, ma si potrebbe sostenere che non è necessario, considerando che Ling ha fatto praticamente tutto il lavoro innovativo sulla determinazione del comportamento dei soluti intracellulari. In particolare, negli anni ’60, lui e Ochsenfeld hanno determinato che questo potassio (e tutti gli altri elettroliti nel citosol) non è generalmente presente in una forma liberamente disponibile, ma è invece adsorbito sulle strutture macromolecolari.

Gli investigatori hanno sfidato le cellule con isotopi radiomarcati e hanno scoperto che questo aveva poco effetto sullo spostamento degli elettroliti già presenti, cosa che ci si sarebbe aspettati se fossero stati distribuiti liberamente. Gli elettroliti intracellulari sono in gran parte presenti in complessi con macromolecole e sono molto meno mobili di quanto ci si potrebbe aspettare da un modello di cellula in cui tutto il contenuto esiste in un sacco acquoso omogeneo. Gli stessi autori (Ling & Ochsenfeld, 1973) hanno successivamente confermato che la mobilità del potassio dal compartimento intracellulare a quello extracellulare era circa un ottavo di quello che ci si potrebbe aspettare dalla semplice diffusione in soluzione libera. Il muscolo di rana ucciso perdeva potassio un po’ più facilmente (il tasso di diffusione era ridotto solo del 25% rispetto a quello previsto), poiché le pompe alimentate dall’ATP smettevano di funzionare e la struttura proteica si disorganizzava.

Così, siamo d’accordo che questi ioni non sono dissolti in un lago di acqua libera intracellulare, ma piuttosto legati in complessi. Questo ancora non risponde alla domanda: quanto di ciò che è lì dentro? A quanto pare, è relativamente facile rispondere a questa domanda. Molto più facile, infatti, di qualsiasi altra domanda sollevata finora in questo capitolo. Basta prendere il proprio citosol, liofilizzarlo e poi misurare la composizione elementare della massa secca. Mason et al (1981) hanno fatto esattamente questo per alcune cellule tubulari renali, prima e dopo la lesione ischemica. I loro risultati sono riprodotti qui sotto, sia sotto forma della tabella originale del 1981 che di un bel Gamblegramma lucido:

Come si può vedere dalle fluttuazioni selvagge della concentrazione di potassio dopo anche 20 minuti di ischemia, la composizione elettrolitica delle cellule è molto più fluida di quella del liquido extracellulare (dove un cambiamento di 20 mmol nella concentrazione di qualsiasi elettrolita sarebbe mal tollerato, a livello di sopravvivenza dell’organismo). Inoltre, ogni stirpe cellulare avrà una concentrazione di ioni intracellulari leggermente diversa. Questo dà origine all’imprecisione dei valori degli elettroliti intracellulari discussi nei libri di testo, e alla loro generale riluttanza a citare qualsiasi numero. Praticamente qualsiasi numero citato sarà sbagliato. Per esempio, i tubuli distali di Mason avevano 11mmol/L di sodio nel loro citosol, ma Poole-Wilson (1975) ha trovato circa 44mmol/L nei miociti del ventricolo sinistro e 20mmol/L nel quadricipite sinistro. Alam et al (1977) danno valori di circa 25 mmol/L per il sodio e 145 mmol/L per il potassio in alcune cellule epatiche in crisi. In breve, l’ambiente disordinato e imprevedibile di ogni data cellula rende difficile citare numeri specifici.