Inhalt und Eigenschaften der intrazellulären Flüssigkeit

Dieses Kapitel ist vage relevant für Abschnitt E(iv) des CICM-Primärlehrplans 2017, der vom Prüfungskandidaten erwartet, dass er „die Zusammensetzung … der intrazellulären Flüssigkeit beschreibt“. Da dies der Abschnitt über die Zellphysiologie ist, wird der Schwerpunkt hier hauptsächlich auf der Mikroebene der Organisation liegen, und alle Diskussionen über das intrazelluläre Körperflüssigkeitskompartiment werden für den Abschnitt über die Körperflüssigkeiten aufgehoben.

Die Tatsache, dass die Prüfer an den Hochschulen ihr Auge nie auf dieses Thema gerichtet haben, verleiht der Diskussion darüber einen fast befreienden Hauch von Sinnlosigkeit, da sich sowohl die Prüfungskandidaten als auch der Autor angenehm bewusst sind, dass jeder die Zeit des anderen verschwendet. Anstatt hier harte Wissenschaft aufzusaugen und prüfungsrelevante Fakten auswendig zu lernen, kann man aus rein medutainmenttechnischen Gründen einfach weiter lesen oder zu Themen übergehen, die mehr Punkte bringen.

Zusammenfassend:

Welche gültigen, von Experten begutachteten Quellen gibt es zu diesem Thema? Leider sind sie zahlreich. Wenn man in einer Suchmaschine oder im Stichwortverzeichnis eines Lehrbuchs nach „intrazelluläre Flüssigkeit“ sucht, erhält man unweigerlich eine Antwort, eine Reihe von Einträgen oder Seiten oder Powerpoint-Folien, die sich zwar inhaltlich alle vage ähneln, sich aber in ihren Zitierwerten unterscheiden und keinerlei Verweise bieten. Viele bieten überhaupt keine nützlichen Informationen. In den offiziellen Hochschulbüchern zu diesem Thema (Ganong, S. 2 der 23. Auflage, und Guyton & Hall, S. 4 der 13. Auflage) wird die zytosolische Elektrolytkonzentration beispielsweise mit Begriffen wie „große Mengen“ beschrieben. Selbst außerhalb der offiziellen Bibliographie haben ansonsten solide Angebote wie Molecular Biology of the Cell keine eindeutigen Antworten. Man ist sich nicht einmal einig, wie man es nennen soll (Cytosol? Protoplasma? Primordialschlauch?)

Glücklicherweise gibt es immer noch Wissenschaftler, die zu diesem Thema veröffentlichen. Der wohl beste Artikel ist der von Katherine Luby-Phelps aus dem Jahr 1999, der im Grunde alles enthält, was man zur Beantwortung hypothetischer zukünftiger SAQs zu diesem Thema brauchen könnte. Ein weiterer hervorragender Beitrag, der sich hauptsächlich mit den Eigenschaften des intrazellulären Materials befasst, ist der kurze Aufsatz von Richard P. Sear (2005). Wenn man wirklich verrückt ist und über die zeitlichen Ressourcen eines fest angestellten Spezialisten verfügt (d. h. keine dringende Verpflichtung, tatsächlich irgendeine nützliche Arbeit zu leisten), kann man stattdessen Gilbert Lings In Search of the Physical Basis of Life (1984) erkunden, ein 800-seitiges Buch, geschrieben von einem Mann, dessen Veröffentlichungen zur Zellphysiologie bis in die 1950er Jahre reichen.

Volumen eines intrazellulären Raums

Wie groß ist eine Zelle? Das hängt natürlich von der Zelle ab. Ein gutes Beispiel für einen Ausreißer ist die Xenopus-Oozyte, das Ei der afrikanischen Kröte, das einen Durchmesser von 1 mm hat. Wenn man über den Menschen spricht, bezieht man sich gewöhnlich auf die intrazelluläre Flüssigkeit, als ob es sich um einen relativ homogenen Eimer handeln würde, aber in Wirklichkeit besteht dieses Flüssigkeits-Kompartiment aus etwa 1014 winzigen Kompartimenten, von denen jedes ein etwas anderes Volumen und eine etwas andere Zusammensetzung hat.

Die Heterogenität all dieser Volumina ist in diesem Kapitel der BioNumbers-Datenbank gut zusammengefasst, in dem alle Arten von akribisch referenzierten Informationen zu finden sind. Es wird hier mit minimalen Änderungen wiedergegeben, für den Fall, dass die Harvard-Server einmal abstürzen.

Volumina von Säugetierzellen

Zelltyp	Volumen (μm3, oder Femtoliter)	Volumen (Pikoliter)	Referenz
Samenzelle	30	0.03	Gilmore et al, 1995
Erythrozyten	100	0.1	Ballas et al, 1987
Lymphozyt	130	0.13	Schmid-Schonbein et al, 1980
Neutrophil	300	0.3	Rosengren et al, 1994
Pankreas β-Zelle	1.000	1.0	Finegood et al, 1995
Enterozyt	1,400	1.4	Wiśniewski et al, 2012
Fibroblast	2,000	2.0	Mitsui et al, 1976
Gebärmutterhalstumor (HeLa)	3.000	3.0	Zhao et al, 2008
Haarzelle (Ohr)	4.000	4.0	Géléoc et al, 1999
Osteoblast	4,000	4.0	Beck et al, 2011
Alveolarmakrophage	5,000	5.0	Krombach et al, 1997
Kardiomyozyt	15.000	15,0	Calvillo et al, 2003
Megakaryozyt	30.000	30.0	Harker et al, 2000
Adipozyt	60.000	60.0	Livingston et al, 1984
Oozyten	4.000.000	4000	Goyanes et al, 1990

Es handelt sich also um eine ziemlich große Bandbreite. Außerdem wird natürlich nicht der gesamte Inhalt der Zelle von „intrazellulärer Flüssigkeit“ eingenommen, unabhängig davon, wie Sie diesen Begriff definieren. Für die Zwecke dieses Kapitels lautet die Definition von intrazellulärer Flüssigkeit beispielsweise „intrazelluläre Inhalte, die keine Organellen sind“, weil Organellen in einem anderen Kapitel behandelt werden. Wir sprechen in diesem Fall von der „gräulichen, zähflüssigen, schleimigen, halbdurchlässigen und halbflüssigen Substanz“, die den intrazellulären Raum zwischen anderen Strukturen einnimmt (Harvey, 1937).

Abhängig von der Art der Zelle, die man betrachtet, kann dieser Raum einen sehr kleinen Teil des Gesamtvolumens ausmachen. Bei dem oben erwähnten omentalen Adipozyten beispielsweise wird von den 60 Picolitern Gesamtvolumen der größte Teil von wasserfreiem Fett eingenommen. Dies lässt sich experimentell nachweisen: DiGirolamo & Owens (1976) konnten berechnen, dass das Wasservolumen in Adipozyten von Ratten etwa 5-7% des Gesamtvolumens ausmacht, also 1,5-2 Picoliter.

Kurz gesagt, wir haben es mit einem sehr kleinen Volumen zu tun. Warum ist das wichtig? Nun. Das innere Flüssigkeitsvolumen der Zelle von 1-2 Picolitern ist das Verteilungsvolumen für lösliche Stoffe. Die Moleküle dieser Stoffe haben also eine sehr kurze Strecke zurückzulegen, bevor sie aufeinander treffen. Dadurch wird die Reaktionsgeschwindigkeit erhöht, was hilfreich ist, da die Gesamtmenge der Reagenzmoleküle in einem so kleinen Volumen zwangsläufig gering ist. Um ein Beispiel von Luby-Phelps (2000) aufzugreifen: Wenn eine Zelle einen Gesamtgehalt von 1 Nanomol eines Proteins hat, bedeutet dies, dass nur 1000 Kopien dieses Proteins in der Zelle vorhanden sind. Bei einem so kleinen Volumen, das durchquert werden muss, wäre ein bindendes Molekül selbst mit geringer Affinität glücklicherweise in der Lage, den Großteil des verfügbaren Substrats aufzuscheuern und zu adsorbieren.

Proteingehalt der intrazellulären Flüssigkeit

Ok, das Volumen ist also klein. Welche Makromoleküle sind darin enthalten, und wie viele davon? Alice B. Fulton (1982) hat darauf die wohl klarste Antwort in der veröffentlichten Literatur gegeben. Grundsätzlich liegt der Proteingehalt von Zellen im Bereich von 17 bis 35 Gew.-%, wobei die meisten Autoren sich auf einen Wert von 20-30 g/100 ml einigen. Fulton zitiert alte Texte (Loewy et al., 1969), um die folgenden Werte anzugeben:

• Muskelzellen: 23% Protein nach Gewicht
• Erythrozyten: 35% des Gewichts an Proteinen
• Die meisten anderen Zellen: 17% bis 26% des Gewichts an Proteinen

Die Messungen erfolgen in der Regel durch Messungen des Brechungsindexes, einer Technik, die in der Regel nicht zwischen strukturellen Proteinen (z.B. denen, aus denen das Zytoskelett und die Organellen bestehen) und löslichen Proteinen, die den Rest des Schleims ausmachen, unterscheidet.

So, was ist der Sinn dieser Diskussion? Nun. Diese Proteinkonzentration ist ziemlich hoch. Sie liegt über der üblicherweise akzeptierten Konzentration großer Polymere, von der man erwarten würde, dass sie die Diffusion anderer ähnlicher Polymere beeinträchtigt, d.h. der Wald ist zu dicht. Chang et al. (1987) erstellten ein mathematisches Modell, das vorhersagt, dass die Diffusionsgrenze für Polymere mit einem Gewicht von 50 kDa und mehr bei etwa 130 g/L liegt, d. h. bei einer höheren Konzentration können andere Polymere nicht mehr so leicht durch die Lösung diffundieren. Sicher, es wurde in Benzol gelöstes Polystyrol verwendet, aber die Tatsache bleibt bestehen. Zum Vergleich: Wenn man ein Protein vollständig kristallisiert, erhält man einen „Feststoff“, der nur zu 40 Gewichtsprozent aus Protein besteht

Zusammenfassend kann man sagen, dass die Proteine in der intrazellulären Flüssigkeit so dicht gepackt sind, dass das Zytosol als „überfüllte Lösung“ bezeichnet werden muss. Das karikaturhafte Diagramm hier (ursprünglich von Goodsell 1993 veröffentlicht und in der Folge von praktisch jedem, der jemals über das Zytosol geschrieben hat, reproduziert) zeigt visuell genau, wie dicht gepackt diese Körper sind. Die Zeichnung wurde unter Verwendung bekannter Größen und Formen von Molekülen/Elektronenmikroskop angenähert, aber Bilder, die mit dem REM aufgenommen wurden (z. B. von Bridgman & Reese, 1984), zeigen, dass sie die chaotische Mikrostruktur des Zytosols korrekt wiedergibt. Betrachtet man Xenopus-Oozyten bei einer Vergrößerung von ~ 80.000, wird ein dichter Wald von Filamenten und Granula sichtbar. Das Bild hier (ein Teil der Abbildung 6) wurde durch Zelllyse und Waschung mit Detergenzien etwas aufgeräumt, um einen Teil der Proteinlast zu entfernen, die sonst die feinere Struktur verdeckt hätte. Die Pfeile zeigen auf die Y- und T-Übergänge der Filamente.

Ohne Detergenzpräparat wird all das feine körnige Material sichtbar, das zwischen diesen Filamenten liegt. Das Bild ähnelt nun weißem Rauschen (dieselben Autoren).

Es ist klar, dass die Diffusion durch dieses Dickicht nicht normal sein wird. Kleinere gelöste Stoffe (z. B. Ihre Natrium- und Kaliumionen) müssen diese riesigen Hindernisse umgehen, indem sie die landschaftlich reizvolle Route zueinander nehmen. Aus praktischer Sicht bedeutet dies, dass jede Reaktion, die von der Diffusionsgeschwindigkeit abhängt, langsamer abläuft. Wenn die Moleküle ewig brauchen, um zueinander zu gelangen, müsste sich die Nettorate ihrer Interaktion eigentlich verringern. Dies ist jedoch nicht der Fall.

Welche chemischen Eigenschaften zeigt diese hochgesättigte Proteinsuppe? Allen P. Minton (2006) hat jahrelange (hauptsächlich eigene) Forschung in einer Tabelle des oben genannten Papiers zusammengefasst. Hier eine Zusammenfassung:

• Erhöhte Bindungsaffinität von ansonsten verdünnten Makromolekülen zueinander
• Beschleunigung von Proteinassoziationen z.B. Selbstorganisation
• Beschleunigung von diffusionsbegrenzten Reaktionen und Proteinassoziationen
• Stabilisierung von Proteinen gegen Hitzedenaturierung

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das Gedränge Proteine zur Faltung und Interaktion zwingt, wodurch komplexe Konfigurationen entstehen, die in einer verdünnten Lösung unmöglich wären. So entdeckte Wilf & Minton 1981, dass verdünnte Myoglobinmoleküle in Lösung wenig Interesse aneinander haben, aber die Zugabe einer 10%igen Lösung eines (beliebigen!) anderen Proteins bewirkt, dass sich das Myoglobin spontan zu Dimeren zusammenfügt.

Eigenschaften von intrazellulärem Wasser

Selbst bei einem kristallisierten Protein sind nur 40 % der Masse tatsächlich Protein. Der Rest ist Lösungsmittel, das die Räume zwischen den gepackten Proteinmolekülen einnimmt (sie sind nicht genau rechteckig und stapeln sich nicht ordentlich). Handelt es sich bei dem Lösungsmittel um Wasser, so wird die Hälfte davon an die Proteinoberfläche adsorbiert, der Rest kann als normales flüssiges Wasser betrachtet werden. In diesem dünnen Film sind die Ionen des intrazellulären Wassers gelöst.

Bei gebundenem, adsorbiertem Wasser liegen die Dinge natürlich etwas anders. Zum Beispiel werden die Lösungsmitteleigenschaften dieses Wassers nicht genau die gleichen sein wie die des „freien“ Wassers. Zum einen wird es wahrscheinlich eine geringere chemische Aktivität aufweisen. Wie zu erwarten, verleiht der „geordnete“ Zustand des Wassers ihm einige ungewöhnliche kolligative Eigenschaften – Foster et al. (1976) stellten beispielsweise fest, dass sein Gefrierpunkt herabgesetzt ist. Darüber hinaus wird es Taschen im Zytosol mit erhöhter Aktivität (um hydrophile Proteinstrukturen) und verringerter Aktivität (um hydrophobe Strukturen) geben.

Wie viel Wasser wird von den Proteinen in diesem gefangenen Zustand gehalten? Das ist etwas schwierig zu sagen. Experimente von Ling et al. (1993) deuten darauf hin, dass der größte Teil des Wassers in den Zellen auf diese Weise „geordnet“ ist, aber die meisten Experimente, die über dieses Thema berichten, werden durch die Tatsache beeinträchtigt, dass die rohen lebenden Zellen, die sie verwenden, verschiedene homöostatische Reaktionen auf die experimentellen Bedingungen haben, die die Ergebnisse verwirren.

Im Allgemeinen versucht man, diese Antwort durch osmotische Dehydrierung der Zellen zu ermitteln. Wenn man einen osmotischen Druck ausübt, so die Überlegung, sollte das gesamte „mobile“ Wasser aus der Zelle austreten. Dann misst man den Wassergehalt der Zelle, und alles, was übrig bleibt, muss „unbeweglich“ sein, geparkt auf der Oberfläche von Proteinmolekülen und unfähig, als Reaktion auf den osmotischen Druck zu wandern. Cameron et al. (1997) präsentieren das Diagramm (schamlos geklaut und hier links abgebildet), in dem der Wassergehalt der verbleibenden Zellen gegen eine x-Achse mit steigendem osmotischen Druck aufgetragen ist. Die Linie des Drucks gegenüber dem verbleibenden Wasser, die aus den experimentellen Daten extrapoliert und in Richtung eines „unendlichen“ osmotischen Drucks verlängert wurde, kreuzte die y-Achse an einem Punkt, der nicht Null war. Je nachdem, welche Zellen man verwendete, lag dieser Punkt zwischen 30 und 90 % des gesamten Wassergehalts.

Tatsächlich scheint es so zu sein, dass dieses an Proteine adsorbierte Wasser das wesentliche Wasser in den Zellen ist und alles „freie“ Wasser sinnloser Ballast ist. Clegg (1981) fand bei der Rehydrierung einiger getrockneter Salinenkrebszellen heraus, dass die Stoffwechselaktivität wieder einsetzte und relativ normal war, wenn die Zellen mit etwa 35 Gew.-% Wasser wiederhergestellt wurden, d.h. etwa so viel, wie zur „Hydratisierung“ aller Makromoleküle zu erwarten ist. In diesen Garnelen war mit ziemlicher Sicherheit kein freies Wasser in der „Massephase“ vorhanden. Sicher, sie versuchten nicht, sich zu vermehren oder RNA zu synthetisieren (dafür war eine Hydratation von 70-80 % erforderlich), aber die Synthese von Aminosäuren und der Gasaustausch verliefen relativ normal. Umso bemerkenswerter ist die Tatsache, dass diese dicke 20-30%ige Proteinsuppe bei objektiver Messung eine Viskosität aufweist, die der von normalem Wasser sehr nahe kommt (Luby-Phelps, 1994)

PH-Wert der intrazellulären Flüssigkeit

Carter (1972) veröffentlichte dazu einen sehr einflussreichen Artikel, der in Lehrbüchern der Humanphysiologie oft zitiert wird, obwohl der Autor Muskeln der Riesenseepocke (Balanus nubilus) verwendete, die er in einer so genannten „Seepocken-Ringerlösung“ suspendierte, einer Salzlösung mit 450 mmol/L Natrium und 518 mmol/L Chlorid. Man kann kaum mit einem gewissen Respekt vor der menschlichen Verallgemeinerbarkeit solcher Daten weiterlesen, aber wenn man es tut, entdeckt man die wichtigste Erkenntnis: dass der pH-Wert in den Zellen so stark kompartimentiert ist, dass verschiedene Regionen des Zytosols wild unterschiedliche pH-Werte haben, in einem Bereich von 6,0 bis 7,5.

Intrazelluläre Elektrolytkonzentrationen

In der Regel wird in allen Lehrbüchern auf die Frage nach der Konzentration der Elektrolyte in der intrazellulären Flüssigkeit ein Gamblegramm wie dieses erstellt (entnommen aus Ling, 1984, ohne Genehmigung seines Nachlasses oder seines Verlags).

Dieses Diagramm wird in Lings Buch nicht erwähnt, aber man könnte argumentieren, dass dies nicht nötig ist, wenn man bedenkt, dass Ling praktisch die gesamte bahnbrechende Arbeit zur Bestimmung des Verhaltens intrazellulärer gelöster Stoffe geleistet hat. Insbesondere stellten er und Ochsenfeld in den 1960er Jahren fest, dass dieses Kalium (und alle anderen Elektrolyte im Zytosol) im Allgemeinen nicht in frei verfügbarer Form vorliegt, sondern an den makromolekularen Strukturen adsorbiert ist.

Die Forscher versetzten Zellen mit radioaktiv markierten Isotopen und stellten fest, dass dies kaum Auswirkungen auf die Verdrängung der dort bereits vorhandenen Elektrolyte hatte, was zu erwarten gewesen wäre, wenn sie frei verteilt gewesen wären. Die intrazellulären Elektrolyte liegen größtenteils in Komplexen mit Makromolekülen vor und sind weitaus weniger mobil, als man bei einem Modell einer Zelle erwarten würde, bei dem der gesamte Inhalt in einem homogenen wässrigen Sack vorliegt. Dieselben Autoren (Ling & Ochsenfeld, 1973) bestätigten später, dass die Mobilität von Kalium vom intrazellulären zum extrazellulären Kompartiment etwa ein Achtel dessen beträgt, was man bei einfacher Diffusion in freier Lösung erwarten würde. Aus abgetötetem Froschmuskel trat Kalium etwas leichter aus (die Diffusionsrate war nur um 25 % geringer als erwartet), da die ATP-getriebenen Pumpen nicht mehr funktionierten und die Proteinstruktur desorganisiert wurde.

Sind wir uns also einig, dass diese Ionen nicht in einem schwappenden See aus freiem intrazellulärem Wasser gelöst sind, sondern eher in Komplexen gebunden. Das beantwortet aber immer noch nicht die Frage: Wie viel von was ist da drin? Wie sich herausstellt, ist diese Frage relativ leicht zu beantworten. Viel einfacher sogar als alle anderen Fragen, die bisher in diesem Kapitel aufgeworfen wurden. Man braucht nur sein Zytosol zu nehmen, es gefrierzutrocknen und dann die elementare Zusammensetzung der Trockenmasse zu messen. Mason et al. (1981) haben genau dies an einigen Nierentubuluszellen vor und nach einer ischämischen Schädigung durchgeführt. Ihre Ergebnisse sind im Folgenden sowohl in Form der Originaltabelle von 1981 als auch in Form eines schönen Gamblegramms wiedergegeben:

Wie man an den wilden Schwankungen der Kaliumkonzentration selbst nach einer 20-minütigen Ischämie sehen kann, ist die Elektrolytzusammensetzung der Zellen viel flüssiger als die der extrazellulären Flüssigkeit (in der eine Konzentrationsänderung von 20 mmol eines beliebigen Elektrolyten schlecht toleriert würde, was für das Überleben des Organismus von entscheidender Bedeutung ist). Hinzu kommt, dass jede Zelllinie eine leicht unterschiedliche intrazelluläre Ionenkonzentration aufweist. Daraus ergibt sich die Ungenauigkeit der intrazellulären Elektrolytwerte, die in Lehrbüchern diskutiert werden, und die allgemeine Zurückhaltung bei der Angabe von Zahlen. Praktisch jede Zahl, die Sie nennen, wird falsch sein. Zum Beispiel hatten die distalen Tubuli von Mason 11mmol/L Natrium in ihrem Zytosol, aber Poole-Wilson (1975) fand etwa 44mmol/L in den Myozyten der linken Herzkammer und 20mmol/L im linken Quadrizeps. Alam et al. (1977) geben Werte von etwa 25 mmol/L für Natrium und 145 mmol/L für Kalium in einigen versagenden Leberzellen an. Kurz gesagt, die chaotische und unvorhersehbare Umgebung einer bestimmten Zelle macht es schwierig, spezifische Zahlen zu nennen.