ABSTRACT
Epidemiológiailag nem kapcsolódó Streptococcus pyogenes törzsek izolálva vérből, torokból és bőrből származó törzseket HEp2 és HaCaT sejtekhez való tapadás szempontjából vizsgálták. Az invazív izolátumok szignifikánsan nagyobb aviditást mutattak ezekre a sejtvonalakra, mint a bőrből és a torokból származó izolátumok. Általában az S. pyogenes nagyobb kötődést mutatott a HaCaT sejtekhez, mint a HEp2 sejtekhez.
A Streptococcus pyogenes (A csoportú streptococcus ) számos emberi betegség etiológiai kórokozója, beleértve a torokgyulladást, a pyodermát és a súlyos invazív betegségeket. Ezenkívül a kórokozót olyan potenciálisan életveszélyes következményekkel hozzák összefüggésbe, mint a posztstreptococcus glomerulonefritisz és az akut reumás láz. Az ausztráliai Északi Területen (NT) az akut reumás láz előfordulása nagyon magas az őslakosok körében (3), annak ellenére, hogy a GAS alacsony torokizolációs aránya. Ezenkívül a GAS-fertőzésből eredő pyoderma rendkívül gyakori, és a posztstreptococcus glomerulonephritis endémiás számos távoli aborigin közösségben (4, 7). Míg a tünetmentes torokfertőzés gyakran az invazív betegséggel összefüggésbe hozható törzsek jelentett rezervoárja (5), azokban a populációkban, ahol az impetigo endémiás, mint például az Aboriginal közösségekben az NT-ben, az elsődleges rezervoár a bőr. Függetlenül attól, hogy melyik szövet a fertőzés elsődleges helye, a kórokozónak először a gazdasejtekhez való tapadást kell elérnie. A S. pyogenes genomja számos olyan gént kódol, amelyek adhézineket kódoló géneknek tekinthetők. Ezek a gének erősen szabályozottak, és az egyes törzsek nem rendelkeznek az összes ilyen fehérje kódolásához szükséges genetikai potenciállal. Az adhézinek közé tartozik az M-protein (egy antifagocita molekula), a kapszula és a fibronectin kötő fehérjék. Számos különböző fibronectinkötő fehérje létezik, például az SfbI (8, 12), a PrtF2 (9, 10), az Fbp54 (2) és az SfbII (11). Az egyes törzsek adhéziós képessége az adott törzs által birtokolt adhézin gének repertoárjától és expressziós szintjétől függően változhat. Ez viszont tükrözheti a különböző szöveti helyek kolonizálására és tartós fertőzésére való képességbeli különbségeket. Ebből következik, hogy a különböző szöveti helyekről származó izolátumok eltéréseket mutathatnak az adherencia-kapacitásban. Ennek tesztelésére meghatároztuk a bőrből, torokból és vérből származó GAS izolátumok kötődésének mértékét a HEp2 és HaCaT sejtvonalakhoz, amelyek emberi gégehámsejteket, illetve keratinocitákat képviselnek.
Az NT-ből származó GAS izolátumokat 1990 és 2002 között gyűjtötték. Az ebben a tanulmányban elemzett 72 törzset vérből (n = 26), bőrből (n = 22) és torokból (n = 24) izolálták (1. táblázat). A vérből származó izolátumok súlyos betegségből, a többi törzs pedig szövődménymentes fertőzésekből származott. Az izolátumokat a korábban leírtak szerint Vir-tipizálták (6). A Vir tipizálása az mga regulon restrikciós töredékhosszúságú polimorfizmusát foglalja magában, amely a nagymértékben változó M fehérje génjét tartalmazza. A járványtani szempontból független törzsek bevonásának biztosítása érdekében minden Vir-típusból egy reprezentatív izolátumot vettek fel. A tenyészeteket egy éjszakán át 37°C-on, orbitális rázógépen, 1%-os élesztőkivonattal kiegészített Todd-Hewitt-lében (Oxoid, Basingstoke, Egyesült Királyság) növesztették stacionárius fázisig. A GAS inokulum előkészítéséhez az adhéziós vizsgálatokhoz az éjszakai tenyészeteket centrifugáltuk, majd a pelleteket foszfát-pufferelt sóoldatban (PBS; Life Technologies Gibco BRL, New York, N.Y.) mostuk, és szérum- és antibiotikummentes RPMI 1640 tápközegben (Life Technologies) 0,05-ös optikai sűrűségűre szuszpendáltuk 600 nm-en. Ez körülbelül 1 × 107-1,5 × 107 baktériumot jelent ml-ben.
A humán gégehámsejteket (HEp2) 10% magzati borjúszérummal (Life Technologies), 1% Fungizone-nal (Life Technologies), 20 μg vancomycin HCl-lel (David Bull Laboratories, Sydney, Ausztrália) ml-ben és 100 μg sztreptomicin-szulfáttal (Sigma, St. Louis, Mo.) ml-ben kiegészített RPMI 1640 táptalajban tartottuk. Az emberi felnőtt bőrkeratinocitákat (HaCaT sejtek) 10% hővel inaktivált magzati borjúszérummal kiegészített Dulbecco’s modified Eagle mediumban (Life Technologies) tartottuk. Az adhéziós vizsgálatokhoz ∼105 sejtet/ml-t vetettünk 12 mm átmérőjű üveg fedőlapokra 24 lyukú szövettenyésztő lemezek (Nunc, Roskilde, Dánia) aljára. Egy éjszakán át tartó, 37°C-on, 5%-os CO2 atmoszférában történő növekedés után a sejteket PBS-szel (pH 7,4) mostuk, majd 500 μl GAS inokulummal oltottuk be. 2 óra 37°C-on történő inkubáció után a fedőlemezeket ötször mostuk 1 ml PBS hozzáadásával minden lyukba, majd óvatos keverés után a mosóoldatot aspirációval eltávolítottuk. A nem tapadó baktériumok eltávolítása után a gazdasejteket és a tapadó baktériumokat 95%-os metanollal fixáltuk és levegőn szárítottuk. A hőfixálást követően a fedőlemezeket tárgylemezekre helyeztük, és Gram-festést végeztünk, hogy olajimmersion alatt megtekinthessük őket. Minden kísérletben több véletlenszerű mezőben lévő sejteket elemeztünk, és a kötődést a GAS-láncok sejtenkénti átlagos számaként fejeztük ki. Minden vizsgálatot két példányban végeztünk, és minden törzs esetében meghatároztuk az átlagos kötődést. Minden statisztikai elemzést a Stata Statistics/Data Analysis program 7.0 verziójával (Stata Corporation, College Station, Tex.) végeztünk. Az adatokat t-tesztekkel elemeztük.
A GAS törzsek mindkét sejttípushoz tapadtak, és a kötődés mértéke törzsről törzsre változott (1. táblázat). A két időintervallumban megismételt 20 izolátummal végzett független kísérletek között jó korreláció volt (az adatok nem láthatóak), ami arra utal, hogy a kötődés aviditása reprodukálható és törzs-specifikus. Összességében a GAS kötődése a HaCaT sejtekhez nagyobb, mint a HEp2 sejtekhez (P < 0,05). Amikor az 1. táblázatban szereplő adatokat az izolálás szöveti helye alapján szétválasztottuk, a vérből származó GAS-törzsek átlagosan 270 lánca kötődött 50 HaCaT-sejthez (1. ábra). Ezzel szemben a bőr- és torokizolátumok átlagosan csak 169, illetve 178 láncot kötöttek 50 HaCaT-sejthez. Ezek a különbségek statisztikailag szignifikánsak (P = 0,0044 és 0,0063). Érdekes módon a HEp2 sejtek esetében a különbségek kevésbé kifejezettek és statisztikailag nem szignifikánsak. Amikor azonban az adatokat az invazív versus szövődménymentes fertőzések alapján újraelemeztük a bőr- és torokizolátumok adatainak kombinálásával, mindkét sejtvonalban szignifikáns különbségeket találtunk a két kategória között (P = 0,0011 a HaCaT esetében; P = 0,0238 a HEp2 esetében).
A laboratórium korábbi munkái kimutatták, hogy a S. pyogenes számos, gyakran keringő törzse okozhat invazív betegséget a bőrrel mint elsődleges fertőzési hellyel (1). Ezek a megfigyelések összhangban vannak a jelenlegi eredményekkel, miszerint az NT GAS törzsek nagyobb aviditást mutatnak a HaCaT, mint a HEp2 sejtvonalak iránt, és a vér izolátumok nagyobb számban képesek kötődni, mint a szövődménymentes fertőzésekből származó izolátumok. A S. pyogenes vérizolátumok magas adhéziós hajlamának lehetséges magyarázatai között szerepelnek az invazív és nem invazív betegségforrásokból származó izolátumok közötti genotípusos és fenotípusos különbségek. További vizsgálatokra van szükség e kötődési aviditás természetének meghatározására, valamint annak megállapítására, hogy az konzisztens-e a klónpopulációkon belül.
- Copyright © 2003 American Society for Microbiology
.