Az anyagok és módszerek
A résztvevők
A vizsgálati személyek 83 ADHD-s gyermek (75% férfi) és 72 TD-s gyermek (51% férfi) voltak, 6 és 13 év között. Az ADHD csoport felvételi kritériumai a következők voltak: (a) az ADHD klinikai diagnózisa a DSM-IV kritériumai szerint, (b) a diagnózis megerősítése a szülőkkel végzett, negyedik kiadású Diagnostic Interview Schedule for Children (DISC-IV-P); ), (c) jelentős ADHD-tünetek, amelyeket a szülői értékelés >90. percentilis a Disruptive Behaviour Disorder Rating Scale (DBDRS; ) legalább egyik ADHD-skáláján (figyelmetlenség és hiperaktivitás/impulzivitás skála), és (d) átható ADHD-tünetek, amelyeket a tanár értékelése >75. percentilis a DBDRS legalább egyik ADHD-skáláján. A társdiagnózis (például ODD vagy ASD) nem volt kizáró kritérium, ahogyan a stimuláns gyógyszeres kezelés sem. A stimuláns gyógyszert szedő gyermekek (N = 50, az ADHD csoport 60%-a) a vizsgálat előtt 24 órával abbahagyták a gyógyszer szedését, hogy lehetővé váljon a teljes kiöblítés , és a vizsgálatban való részvétel alatt. A TD csoport felvételi kritériumai a következők voltak: (a) bármely fejlődési vagy viselkedési rendellenesség (beleértve az ADHD-t és az ODD-t) klinikai diagnózisának hiánya, és (b) a DBDRS szülői és tanári értékelésű ADHD-skáláján elért <90. percentilis pontszámok.
anyag
Viselkedés.
Az ADHD-csoportba bevonható gyermekek szüleit a DISC-IV-P zavaró viselkedési rendellenesség szakaszával értékelték. A DISC-IV-P egy széles körben használt, standardizált diagnosztikai interjú a DSM-IV gyermekkori pszichiátriai zavarok felmérésére, amely megfelelő pszichometriai tulajdonságokkal rendelkezik.
Az ADHD és TD csoportba tartozó gyermekek szülei és tanárai kitöltötték a DBDRS-t az ADHD tüneteinek, valamint az ODD és CD tüneteinek felmérésére. A DBDRS négy skálát tartalmaz, amelyek a figyelmetlenség, hiperaktivitás/impulzivitás, ODD és CD tüneteit mérik egy 4 pontos Likert-skálán (0-tól 3-ig terjedő skálán), ahol a magasabb pontszámok rosszabb tüneteket jeleznek. A DBDRS megfelelő pszichometriai tulajdonságairól számoltak be .
Az ADHD tüneteinek és normális viselkedésének erősségeit és gyengeségeit értékelő skálát (SWAN; ) szülők és tanárok töltötték ki az ADHD tüneteinek felmérésére. Ez a széles körben használt kérdőív két alskálát tartalmaz; a figyelmetlenségi skálát és a hiperaktivitás/impulzivitás skálát, amelyek mindegyike 9 tételből áll. A tételeket egy 7 pontos Likert-skálán értékelik (-3-tól +3-ig terjedő skálán), ahol a magasabb pontszámok rosszabb tüneteket jeleznek. A tételek az ADHD DSM-IV tünetein alapulnak, de az egyes ADHD-tünetekben leírt viselkedés mindkét végletét (erős és gyenge) tükrözik. A két alskála átlagos pontszámait használták függő változóként. A SWAN megfelelő pszichometriai tulajdonságairól számoltak be .
Az ADHD tüneteit a szülők és tanárok által kitöltött, 65 tételből álló Social Responsiveness Scale (SRS; ) segítségével értékelték. Az SRS tételei az ASD DSM-IV tüneti területein alapulnak, beleértve a szociális interakció zavarát, a kommunikációs hiányosságokat és a korlátozott/sztereotipikus viselkedési mintákat vagy érdeklődési köröket. Az SRS egy 4 pontos Likert-skálát használ (0-tól 3-ig terjedő skálán), és a teljes SRS-skála összesített pontszámát használták függő mérőszámként, ahol a magasabb pontszámok rosszabb tüneteket jeleznek. Az SRS megfelelő pszichometriai tulajdonságokkal rendelkezik.
Vérfoltok.
A triptofán, tirozin és fenilalanin vérkoncentrációjának vizsgálatához szárított vérfolt technikát alkalmaztak. A vérfoltok gyűjtése kevésbé invazív a gyermekek számára, mint a vénás vérminták vétele, és a szárított vérfolt technika kellően robusztus és stabil diagnosztikai célokra . A vérfoltok AAA-koncentrációja nagymértékben korrelál a szérum AAA-koncentrációjával (rs 0,86 és 0,96 között). Minden gyermektől egyszer használatos biztonsági lándzsával vettek egy vérfoltot. Három vércseppet vérfestékkártyára fújtak. A szárított vérfolt 5,5 mm-es lyukasztóját 100μl belső standard oldattal (amely 29μM L-fenilalanin-D5-öt, 6μM L-tyrozin-D4-et és 5μM L-triptofán-D5-öt tartalmaz) és 400μl metanollal kevertük egy gázkromatográfiás üvegben (GC-vial), majd 15 percig ultrahangos fürdőben ráztattuk. A felülúszót átvittük egy másik GC-fiolába, és 30°C-on nitrogén alatt bepároltuk. Ezt követően a mintát 100μl 5,5%-os acetil-kloriddal (n-butanolban) butiláltuk 60°C-on 15 percig. Ezt követően a butanol-réteget nitrogén alatt (30°C-on) bepároltuk, és a maradékot 500μl acetonitrilben feloldottuk. A triptofán, tirozin és fenilalanin vérpontkoncentrációját pozitív elektrospray folyadékkromatográfiás-tandem tömegspektrometriával (LC-MS/MS) határoztuk meg, egy API 3000 háromszoros négypólusú tömegspektrométer (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) és egy nagy teljesítményű folyadékkromatográfiás (HPLC) rendszer (Perkin Elmer Series 200, Shelton, USA) segítségével. A mintából három μl-t injektáltunk egy szimmetrikus C18 oszlopra (3,9*150mm, 5μm; Waters, Milford, MA, USA), és 1 ml/perc áramlási sebességgel 75%-os acetonitrilt (amely 0,4% hangyasavat tartalmaz) eluáltunk. A triptofán, tirozin és fenilalanin 1 percen belül eluálódott, és a következő átmenetekkel mértük: tömeg-töltés arány (m/z) 261,2→159,2 (triptofán), m/z 238,2→136,2 (tirozin) és m/z 222,2→120,2 (fenilalanin). Az összes kapott LC-MS/MS adatot az Analyst 1.4.2 szoftver (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) segítségével vettük fel és dolgoztuk fel. A triptofán, tirozin és fenilalanin vérfoltkoncentrációját μmol/l-ben fejeztük ki. Az LC-MS/MS megbízhatóságát a vizsgálatok közötti szórás (5-10%), a vizsgálatokon belüli szórás (8-10%) és a visszanyerés (90-112%) vizsgálatával igazoltuk.
Étrendi fehérjebevitel.
A napi fehérjebevitelt három nap alatt, a szülők által jelentett táplálkozási napló segítségével értékeltük. Szabványosított étrendi feljegyzéseket és utasításokat adtak. A szülőket arra utasították, hogy minden elfogyasztott ételt és italt jegyezzenek be az étrendi feljegyzésbe, és a lehető legpontosabban fejezzék ki az elfogyasztott mennyiségeket. A fehérjebevitel mennyiségét (gramm/nap) a holland élelmiszer-összetétel adatbázis számítógépes változata alapján számították ki. A holland élelmiszer-összetételi adatbázis több mint 2000 élelmiszert tartalmaz, amelyek tápanyag-összetételére vonatkozó információkkal vannak ellátva. Az adatbázist széles körben használják tudományos célokra (pl.).
Húgy.
A vizelet AAA koncentrációjának vizsgálatához a résztvevők 18 egymást követő órában (iskola utáni órákban) ürített összes vizeletet összegyűjtötték egy vizeletgyűjtő edénybe. A vizeletgyűjtés ideje alatt a tartályt hűtőszekrényben (<5°C) tárolták. Egy 10 ml-es mintát küldtek egy laboratóriumba elemzésre, ahol a mintát -20°C-on tárolták. A vizeletben lévő triptofán analízisére fluoreszcens detektálással ellátott HPLC technikát alkalmaztak. A vizeletben lévő tirozin és fenilalanin koncentrációját Biochrom aminosav-analizátorral határozták meg. A triptofán, tirozin és fenilalanin vizeletkoncentrációját a poliuria vagy oliguria hatásainak kizárása érdekében a vizelet teljes térfogatához viszonyított μmol arányban fejezték ki. A HPLC-technika megbízhatóságát az elemzések pontosságának vizsgálatával igazoltuk, amely a triptofán esetében 2,25% (relatív szórás), a tirozin és a fenilalanin esetében pedig 1,50% volt. A 12 órás minták és a 24 órás minták aminosav-koncentrációi között magas korreláció mutatkozik, ami azt jelzi, hogy az aminosavak kiválasztásában nincs napszakos eltérés, ami igazolja a 18 órás minta használatát a jelenlegi vizsgálatban.
Eljárás
Ezt a vizsgálatot a VU University Medical Center Amsterdam, Hollandia helyi orvosi etikai bizottsága hagyta jóvá (#NL39922.029.12), és az 1964-es Helsinki Nyilatkozatban és annak későbbi módosításaiban meghatározott etikai normáknak megfelelően végezték. A részvételt megelőzően minden gyermek szüleitől és a ≥12 éves gyermekektől írásbeli, tájékozott beleegyezést kértek. Az ADHD-s gyermekeket a mentálhigiénés ambulanciákon, a viselkedési problémákkal küzdő gyermekek szülői szövetségén és egy egyetemi kutatási honlapon keresztül toborozták. A TD csoportot az ország különböző pontjain található általános iskolákból toborozták. A stimuláns gyógyszert szedő gyermekek a részvétel előtt egy nappal (0. nap) abbahagyták a gyógyszerhasználatot a teljes kiöblítés biztosítása érdekében, valamint a vér-, vizelet- és táplálékbevitel felmérése során (1.-3. nap). Az 1. napon a vérfoltot kora reggel vették le, hogy kizárják a vér AAA-koncentrációjának napszakos ingadozásának hatását. Ugyanezen a napon, az iskolaidő után kezdődött a vizeletgyűjtés, amely a következő 18 órában folytatódott, amíg a gyermek másnap reggel vissza nem tért az iskolába (2. nap). Az 1. nap kora reggelén a szülők részletes utasításokat kaptak arról, hogyan kell kitölteni az étrendi nyilvántartást és hogyan kell gyűjteni gyermekük vizeletét. Az instrukciók után a szülők megkezdték gyermekük táplálékbevitelének rögzítését, amely a következő három napon át (1. naptól a 3. napig) folytatódott. A szülőket és a tanárokat felkérték, hogy egy biztonságos weboldalon töltsék ki a kérdőíveket. Az összes adatgyűjtés 2013 februárja és 2014 júliusa között zajlott. Az ADHD és a TD csoportot egyszerre toborozták, hogy ellenőrizzék a táplálékbevitelre vagy az AAA anyagcserére gyakorolt esetleges szezonális hatásokat.
Adatelemzés
Minden statisztikai elemzést az R 3.2.1-es verziójával végeztünk. Minden változót külön-külön vizsgáltunk a kiugró és hiányzó értékek tekintetében az ADHD és a TD csoport esetében. A kiugró értékekre Winsorisingot alkalmaztunk, ezeket egy egységgel nagyobb (vagy kisebb) értékkel helyettesítettük, mint az előző legszélsőségesebb pontszám a csoport eloszlásában . A vizeletkoncentrációk, a táplálkozási adatok és a viselkedési adatok hiányzó adatait véletlenszerűen elosztották és a csoportátlagokkal helyettesítették. A vérfoltok esetében nem voltak hiányzó adatok. Minden adat normális eloszlású volt, kivéve a CD tüneteit. A nemek közötti csoportkülönbségeket chi-négyzetpróbával, az életkor és a viselkedési funkciók közötti csoportkülönbségeket pedig független mintás t-próbával vizsgáltuk.
Az első hipotézis teszteléséhez az AAA vérfoltkoncentrációk csoportkülönbségeit varianciaanalízissel (ANOVA) vizsgáltuk, a csoportot (ADHD vagy TD) fix faktornak tekintve. A hatásméreteket parciális eta-négyzetben számoltuk ki, és kis (> .01), közepes (> .06) vagy nagy (> .14) értékként értelmeztük. Ezenkívül esélyhányadosokat is számítottak, amelyek kifejezték annak kockázatát, hogy az átlag alatti AAA-koncentrációval ADHD-t diagnosztizálnak. Az AAA-koncentrációra vonatkozó normatív adatokat egy 6-13 éves gyermekekből álló nagy mintából (N = 104, 52% fiú) nyerték (nem publikált adatok, a minta adatai és az eredmények a szerzőktől szerezhetők be). Minden egyes AAA esetében a normatív minta legalsó 16. percentilisének (M-1 SD) megfelelő koncentrációkat használták küszöbértékként az átlag alatti AAA-koncentrációk meghatározásához (triptofán 45 μmol/l, tirozin 39 μmol/l és fenilalanin 47 μmol/l esetében). Az esélyhányadosokat 95%-os konfidenciaintervallumukkal együtt számítottuk ki, és Fisher’s Exact tesztet végeztünk az esélyhányadosok szignifikanciájának vizsgálatára.
A második hipotézis tesztelésére Pearson product-moment korrelációs együtthatókkal vizsgáltuk a vérfolt AAA-koncentrációja és az ADHD szülői és tanári értékelésű tünetei közötti kapcsolatot. A korrelációs együtthatók nagyságát kis (>.10), közepes (>.30) vagy nagy (>.50) értékként értelmeztük . Az ADHD csoport és a TD csoport adatait összevonták, hogy maximalizálják az ADHD tüneti mérések variabilitását.
A harmadik hipotézis tesztelésére a teljes mintán korrelációs elemzéseket végeztek a vérpont AAA-koncentráció és a fehérjefogyasztás, valamint a vizelet AAA-koncentrációja között. Azt is megvizsgáltuk, hogy vannak-e csoportkülönbségek a fehérjefogyasztásban és a vizeletben mért AAA-koncentrációkban, ANOVA-analízisek segítségével, a csoportot (ADHD vagy TD) fix faktornak tekintve. Végül korrelációs elemzésekkel értékeltük, hogy a vérfolt AAA-koncentráció összefügg-e a szülők és tanárok által jelentett komorbid pszichiátriai zavarok tüneteivel (Pearson product-moment korrelációs együtthatók ODD és ASD esetében, Spearman-féle rangkorrelációs együtthatók CD esetében). Ha az ODD, a CD vagy az ASD tünetei összefüggést mutattak az AAA-koncentrációkkal, a korábbi elemzéseket újra elvégeztük úgy, hogy ezeket a tüneteket kovariátorként adtuk meg. A többszörös tesztelés korrekciója érdekében a korrelációs elemzések alfa-szintjét a Bonferroni-eljárás szerint eredménytartományonként kiigazítottuk; ADHD-tünetek (12 elemzés, így p = .004), a vérfoltok AAA-rendellenességeinek lehetséges meghatározói (12 elemzés, így p = .004) és a komorbid pszichiátriai zavarok tünetei (18 elemzés, így p = .003). A Bonferroni által korrigált eredményeket közöljük.