A metilált O6-metilguanin-DNS-metiltranszferáz (MGMT) kópiaszámát a béta-aktin (ACTB) kópiaszámához viszonyítva határozzuk meg valós idejű metilációs specifikus polimeráz láncreakcióval (MSP). Ehhez a tumorszövetek tartalmát kézi mikrodissectióval dúsítják, amelyet DNS-extrakció követ. A DNS-t Picogreen segítségével számszerűsítjük, és biszulfitos kezeléssel módosítjuk, amelynek hatására a nem metilált citozinok uracillá alakulnak, míg a metilált citozinok változatlanok maradnak. Ezt követően valós idejű metilációs specifikus PCR-t (MSP) végeznek a Quantstudio 5 műszerrel az MGMT és az ACTB kópiaszámának számszerűsítésére (1). Ez a technika abból áll, hogy PCR-t végeznek valós idejű detektálással az amplifluor detektáló rendszer segítségével. Az ismeretlen kópiaszámú mintákat a Ct-értékeiknek a plazmid standardgörbe értékeivel való összehasonlításával lehet számszerűsíteni.
Klinikai vonatkozások
A MGMT egy DNS-javító enzim, amelyet a humán rákban gyakran deaktivál a hipermetiláció. Ha a sejtekben hiányzik az MGMT aktivitása, a DNS-károsodások nem javulnak megfelelően, így az egyén hajlamosabb a rák kialakulására. Érdekes, hogy az MGMT-aktivitás hiánya a daganatsejteket érzékenyebbé teszi a sugárkezelésre és bizonyos alkiláló gyógyszerekre, például a temozolomidra (2). A nemzetközi prognosztikai III. fázisú (RTOG 0525) validációs vizsgálatban az MGMT-teszt sikeresen azonosította azokat az újonnan diagnosztizált glioblasztómás betegeket, akik nagyobb valószínűséggel élnek tovább és hosszabb progressziómentes idővel rendelkeznek a temozolomid-kezelést követően (3-5). Nemrégiben jelent meg egy új publikáció, amelyben mind a metilált, mind a “szürke zónás” betegek szignifikánsan jobban teljesítettek az általános túlélés tekintetében, mint a valóban nem metilált betegek (6).
Mintakövetelmények
A vizsgálathoz elfogadható minták a formalinban fixált, paraffinba ágyazott glióma szövetminták, 6-48 órás fixálási idővel.
Térfogat
Egy reprezentatív paraffinblokk előnyben részesül. Alternatívaként 5 festetlen szövetszelvény is elfogadható (1 db 5 µm vastagságú tárgylemez a H&E festéshez és legalább 4 db 5-10 µm vastagságú tárgylemez az MGMT vizsgálathoz).
Tárolási és szállítási utasítások
A minták tárolása és szállítása környezeti hőmérsékleten történik.
Korlátozások
Egyes minták esetében érvénytelen eredményt kapunk, mivel az ACTB-kópiák száma nem elegendő, és az MGMT-kópiák száma a kimutatási határ alatt van. Ez többnyire a DNS elégtelen mennyiségével és/vagy minőségével magyarázható. Az olyan érvénytelen minták esetében, amelyekben az MGMT és/vagy ACTB kópiaszám a LOD/LOQ és a határérték körül van, ajánlott a biszulfitkezelt DNS-ből kiindulva ismételt vizsgálatot végezni. A formalinon kívüli fixálószerek vagy a hosszabb fixálási idő nem megfelelő eredményeket eredményezhet.
Speciális követelmények
Nincs
Feldolgozási idő
Öt-7 munkanap a tárgylemezek és a paraffinblokkok esetében.
- Vlassenbroeck I et al. Validation of Real-Time Methylation-Specific PCR to determine O6-Methylguanine-DNA Methyltransferase Gene Promotor Methylation in Glioma. J Mol Diagn. 2008 Jul;10(4):332-7
- Hegi ME et al. MGMT gene silencing and benefit from temozolomide in glioblastoma. N Engl J Med 2005 Mar 10;352(10):997-1003.
- Gilbert MR et al. Dose-dense temozolomide for newly diagnosed glioblastoma: a randomized phase III clinical trial.(7). J Clin Oncol. 2013 Nov 10;31(32):4085-91.
- Malmström A et al. Temozolomid versus standard 6 hetes sugárkezelés versus hipofrakcionált sugárkezelés 60 év feletti glioblasztómás betegeknél: a Nordic randomizált, fázis 3 vizsgálat. Lancet Oncol 2012 Sep; 13(9): 916-926.
- Wick W et al. Temozolomide chemotherapy alone versus radiotherapy alone for malignant astrocytoma in the elderly: the NOA-08 randomized, phase 3 trial. Lancet Oncol 2012 Jul; 13(7): 707-715.
- Hegi ME et al. MGMT Promoter Methylation Cutoff with Safety Margin for Selecting Glioblastoma Patients into Trials Omitting Temozolomide. Négy klinikai vizsgálat összevont elemzése. Clin Cancer Res 2019 Mar 15; 25(6): 1809-1816.
Frissítve 2019. május 23-án
.