Mechanism of synergistic actin filament pointed end depolymerization by cyclase-associated protein and cofilin

DNS konstrukciók

Minden egér N-CAP fehérje, N-CAP-GFP, teljes hosszúságú CAP1, a HFD domén, a HFD domén GST-fúziója és a twinfilin C-terminális ADF-H doménje, klónoztuk pSUMOck4 bakteriális expressziós vektorba (Inari Kursula, University of Bergen, Norvégia szíves adománya), hogy egy SUMO-jelölt fúziós fehérjét fejezzenek ki, amely a SENP2 proteázzal történő hasítás után natív N-terminust hagy. A CARP domén és a C-CAP konstrukciókhoz pCoofy18 bakteriális expressziós vektort használtunk (az Addgene szíves ajándéka). A fehérjekonstrukciók és a konstrukciók klónozásához használt primerek részleteit lásd a 2. kiegészítő táblázatban.

Expresszió és tisztítás CAP fehérjék és fragmentumai

A teljes hosszúságú CAP1 kivételével minden egér CAP fehérjét és annak fragmentumait +22 °C-on LB önindukciós közegben (AIMLB0210, Formedium) 24 órán keresztül BL21(DE3) E. coli (Novagen-től).

A teljes hosszúságú egér CAP1-et LB médiumban expresszáltuk ArcticExpress (DE3) E. coli sejtek segítségével. Először kanamicint (20 µg/ml) és gentamicint (20 µg/ml) tartalmazó starterkultúrát oltottunk be, amelyet 6 órán át inkubáltunk +37 °C-on. A 3,6 literes, csak kanamicint (20 µg/ml) tartalmazó főtenyészetet beoltottuk, és a 3,6 literes főtenyészetet ~0,4 OD600 értékig növesztettük +37 °C-on, 240 rpm-es rázással. A tenyésztési hőmérsékletet 1 órára +13 °C-ra változtattuk a fehérjeexpresszió előtt, amelyet 0,26 mM IPTG hozzáadásával indukáltunk 46 órán keresztül. Minden baktérium pelletet centrifugálással gyűjtöttünk, 50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 25 mM imidazol, pH 7,5-ben reszuszpendáltunk, folyékony N2-vel gyorsfagyasztottuk és -80 °C-on tároltuk.

Az összes CAP fehérjét és a twinfilin ADF-H doménjét hasonló munkafolyamat segítségével tisztítottuk. Először a baktériumokat szonikációval lizáltuk lizozim (0,5 mg/ml), DNSse (0,1 mg/ml) és proteáz inhibitorok (200 µg/ml PMSF, 1 µg/ml leupeptin, 1 µg/ml aprotinin, 1 µg/ml pepstatin A; mind a Sigma-Aldrich-tól) jelenlétében, majd a lizátumot centrifugálással tisztítottuk. A felülúszót 1 ml HisTrap HP Ni-NTA oszlopra töltöttük (GE Healthcare), és alaposan mostuk (>20 oszloptérfogat) 50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 25 mM imidazol, pH 7,5 oldattal. A fehérjéket 25-250 mM imidazol gradienssel eluáltuk AKTA Pure gépen (GE Healthcare). A csúcsfrakciókat összevontuk, és SENP2 proteázt adtunk hozzá 40 µg/ml végső koncentrációban a SUMO-tag eltávolításához. A keveréket 4 °C-on O/N dializáltuk SnakeSkin dialíziscsővel 1 l 20 mM HEPES, 300 mM NaCl, 2 mM DTT, pH 7,4 pufferben. Másnap a hasított SUMO-címkéket Ni-NTA agarózgyöngyökkel (Qiagen) távolítottuk el, amennyiben a SUMO-címke és a hasított fehérje azonos méretű volt. A fehérjéket Amicon Ultra-4 10 kDa centrifugaszűrővel (Merck) koncentráltuk és HiLoad 16/600 Superdex 200 gélszűrő oszlopra (GE Healthcare) töltöttük, amelyet 5 mM HEPES, 100 mM NaCl, 1 mM DTT, pH 7,4-ben egyensúlyoztunk. A csúcsfrakciókat összegyűjtöttük, koncentráltuk, és N2-ben lefagyasztva -80 °C-on tároltuk.

A teljes hosszúságú CAP-ot a következő kivételekkel tisztítottuk. Az 1 ml-es oszlop helyett 5 ml-es HisTrap HP Ni-NTA oszlopot használtunk. A HiLoad 16/60 Superdex 200 gélszűrő oszlopon végzett dialízis és gélszűrés után a fő csúcsfrakciókat Superose 6 increase 10/300 GL gélszűrő oszlopon futtattuk át az oligomer állapotok keverékének jobb elválasztása érdekében. Végül a több futtatásból származó fő csúcsokat egyesítettük, 5 perces spin-intervallumokkal Amicon Ultra-4 30 kDa centrifugaszűrővel koncentráltuk, és a fentiek szerint tároltuk. A CARP és C-CAP fehérjéket a fentiek szerint tisztítottuk, kivéve a 3C proteáz (0,01 mg/ml) használatát a címkék hasításához.

Más fehérjék

A nyúl izomaktin, a jelölt aktinok, a profilin, az egér cofilin-1, a fedőfehérje és a biotin-gelsolin a hivatkozásban leírtak szerint készültek. 16. Az ADP-aktint a hivatkozásban leírtak szerint állítottuk elő. 34. Röviden, 30 µM ATP-G-aktin oldatot, amely 0,3 mM glükózt és 1 egység/ml hexokinázt (Sigma) tartalmazott, nukleotidcsere pufferrel (5 mM Tris-HCl, 0,1 mM MgCl2, 0,05 mM EGTA, 0,2 mM ADP, 1 mM DTT, pH 8,0) szemben 4 órán keresztül 4 °C-on dializáltuk. Minden kísérletet nyúl izom α-aktinnal végeztünk.

Aktin hegyes végű depolimerizációs vizsgálatok

Az aktin filamentum hegyes végű depolimerizációs sebességének mérését mikrofluidikai eszközzel végeztük, amelyhez mikroszkópos elrendezést párosítottunk, a leírtak szerint16. Röviden, egy kamrát készítettünk poli-dimetil-sziloxánnal (PDMS, Sylgard), amelyet egy megtisztított fedőlapra szereltünk. A mikrofluidikai kamrák 20 µm magasak voltak. A három bemenet és a kimenet különböző biokémiai összetételű oldatokkal töltött nyomásszabályozott csövekhez csatlakozott (Fluigent mikrofluidikai eszköz).

A rögzítés után a kamrákat dH20 és F-pufferrel (5 mM HEPES pH 7,4, 100 mM KCl, 1 mM MgCl2, 0,2 mM EGTA, 0,4 mM CaCl2, 0,2 mM ATP, 10 mM DTT és 1 mM DABCO) öblítettük. A kamrát ezután egymás után a következőknek tettük ki: 150 µl 0,1%-os biotin-BSA-t F-pufferben; 300 µl 5%-os BSA-t; 150 µl 3 µg/ml neutravidint F-pufferben; és 10-100 µl 1-3 pM biotin-gelsolint. A kísérletek előtt az aktin filamentumokat polimerizáltuk (8 µM, >30 perc) F-pufferben. Az aktin-monomerek egy frakcióját Alexa-488 vagy 568 jelzéssel jelöltük. A filamentumokat végül befecskendeztük a kamrába, és a kívánt sűrűségig a fedőlaphoz rögzítettük a gelsolinokkal.

A cofilinnel díszített hegyes végek depolimerizációs sebességének méréséhez a filamentumokat először 2 µM cofilinnel telítettük, majd különböző CAP-fehérjékkel kiegészített 2 µM cofilinnek tettük ki. A depolimerizációs sebességet ImageJ segítségével elemeztük, először kymográfot készítettünk minden egyes filamentumhoz (függvény reslice), és kézzel illesztettünk egy meredekséget a hegyes vég mentén. Azokat a filamentumokat, amelyek hegyes vége nem volt egyértelműen nyomon követhető, vagy esetlegesen (nem)megfigyelt szüneteket53 vagy leválási eseményeket mutattak, kihagytuk az elemzésből.

A fehérje jelölésének a méréseinkre gyakorolt hatásának minimalizálása érdekében a mikroszkópos elrendezéstől függően az aktin 10%-os vagy 16%-os jelölési frakcióját használtuk. Kísérleteinkben nem tapasztaltuk a jelölési frakció hatását az N-CAP aktivitásra. Minden kísérletet szobahőmérsékleten, nem hőmérséklet-szabályozott elrendezésben végeztünk.

Az aktin filamentumok újraolvadása

Az újraolvadás számszerűsítése céljából különböző fluoreszcens jelölésekkel ellátott, állandósult állapotú F-aktin oldatokat (F-pufferben) kevertünk és inkubáltunk. A kevert oldat 4 µM Alexa568-aktint (10%-os jelöléssel) és 4 µM Alexa488-aktint (10%-os jelöléssel) tartalmazott, N-CAP-pal és mutánsokkal vagy anélkül. A szobahőmérsékleten 4 percig tartó, kevert F-aktin oldatot 100× hígítottuk 0,2% metilcellulózzal kiegészített pufferben, majd két fedőlap közé szorított, kétoldalas szalaggal készített nyitott kamrába áramoltattuk, és BSA-val passziváltuk. A képsorozatokat (2 s időközzel) legalább három különböző látómezőben vettük fel. Megszámoltuk a zöld (Alexa488) F-aktin szegmensek számát, valamint azoknak a szegmenseknek a számát, amelyek egy piros (Alexa568) F-aktin szegmenshez kapcsolódtak, hogy meghatározzuk a 2f. ábrán ábrázolt két színű szegmens arányát. A filamentumok diffúziójának nyomon követése lehetővé tette, hogy egyértelműen meghatározzuk, mikor kapcsolódott össze két szegmens. A kontrollokat (N-CAP nélkül az F-aktin keverékben) többször, a kísérleteket (N-CAP-pal vagy mutánsokkal) pedig legalább kétszer ismételtük meg.

Aktin leválási próbák

Az N-CAP-nak a cofilin általi leválásra gyakorolt hatásának vizsgálatához két különböző módszert alkalmaztunk: (1) vagy az egyes cofilin-domének azon frakciójának mérésével, amelyek még nem vezettek leváláshoz, vagy (2) a leválási események globális számának számszerűsítésével az aktin filamentum µm-enként.

(1) Az egyes cofilin-doménekhez kapcsolódó leválás (3c. kiegészítő ábra). A korábban leírt eljárást követtük16. Röviden, egy mikrofluidikus kamrában 12% Alexa-488-mal jelölt aktin filamentumokat polimerizáltunk spektrin-aktin magokból, amelyeket nem specifikusan egy BSA-passzivált fedőlapra horgonyoztunk. A filamentumokat 15 percig öregítettük egy kritikus koncentrációjú G-aktin oldattal (100 nM G-aktin), hogy a filamentumok >99%-ban ADP46-ossá váljanak. Ezután a filamentumokat folyamatosan 500 nM mCherry-kofilin-1-nek tettük ki egyedül, 2 µM teljes hosszúságú CAP1-gyel vagy 10 µM N-CAP-pal. ImageJ segítségével ezután kymográfiákat készítettünk a filamentumokról, hogy nyomon követhessük az egyes cofilin-domének nukleációját és összeszerelődését, valamint a csupasz aktinszegmensekkel való határfelületen történő leválási eseményeket.

Minden domén esetében a 0 időt azon a képkockán határoztuk meg, amelyen nukleálódtak. Ezután vagy azt az időpontot rögzítettük, amikor leválási eseményt indukáltak, vagy amikor egy másik domén általi leválás, összeolvadás vagy cenzori esemény miatt elvesznek. Ezután a klasszikus Kaplan-Meier-módszerrel kiszámítottuk azoknak a doméneknek a hányadát, amelyek nem indukáltak leválási eseményt.

(2) A leválási események teljes száma/µm (3d. kiegészítő ábra). Az áramlási kamrák belsejébe (két, kétoldalas szalaggal elválasztott fedőlapok közé) először prepolimerizált Alexa-488-mal jelölt filamentumokat injektáltunk (F-pufferben, 0,2-0,3% metilcellulózzal). Ezután az oldatot 500 nM nem jelölt cofilin-1-gyel és 0, 1 vagy 10 µM NCAP-pal cseréltük ki. A csere után a felszín közelében maradt filamentumokat a következőképpen elemeztük.

A szakadási események µm-enkénti számát a kumulatív függvény

ahol Nsev(u) az u időpontban bekövetkezett leválási események száma, és \(\(\mathop {\sum}\nolimits_i {l_{i(u)}}}\) az összes i szál hosszának összege az u időpontban. Mivel az oldat nem tartalmaz G-aktint, a filamentumok depolimerizálódnak, így a filamentumok hossza idővel csökken.

N-CAP kötődése a filamentumok hegyes végéhez

A kísérletet biotin-PLL-PEG-vel passzivált és neutravidinnel funkcionalizált áramlási kamrákban végeztük (lásd Aktin leválasztási vizsgálat (2)). Az F-aktint (10% Alexa-568, 1% biotin) egy éjszakán át 4 µM-on polimerizáltuk. Közvetlenül a kamrába történő befecskendezés előtt az F-aktint 200 nM-re hígítottuk, és 100 nM N-CAP-GFP-vel, 2 µM cofilin-1-gyel és 4 nM fedőfehérjével kevertük, 0,2% metilcellulózzal kiegészített F-pufferben. Az aktin filamentumok képeit a GFP-csatorna folyamfelvétele előtt és után vettük fel (5 képkocka/másodperc 12 s alatt, TIRF-mikroszkópia). A filamentumvégekhez való kötődés elemzéséhez vakon kiválasztottuk azokat az aktin filamentumokat, amelyek nem mozogtak a stream felvétel során. A fluoreszcenciát minden filamentum két végén, egy 3 x 3 pixeles területen mértük. Kötődési eseményt akkor detektáltunk, ha a fluoreszcencia egy tetszőleges küszöbérték fölé emelkedett (minden filamentum és filamentumvég esetében ugyanaz az érték). Mivel a fedőfehérjének a szöges véget kell védenie, a hegyes véget a legtöbb kötődési eseményt mutató végnek tulajdonítottuk. Az N-CAP-GFP-t az adatpontok 17%-ában detektáltuk a filamentum hegyes végén, míg az N-CAP-GFP nem specifikus társulását a filamentum szöges végének közelében az adatpontok 1,7%-ában észleltük. Ezután kiszámítottuk az N-CAP túlélési frakcióját a hegyes végen, és egy exponenciális értékkel illesztettük a nemkötési sebesség mérésére.

Kristályosítás és szerkezetmeghatározás

Az egér HFD domént 10×His-tag jelenlétében kristályosítottuk, és a fent leírtak szerint tisztítottuk, azzal a kivétellel, hogy a gélszűréshez 5 mM HEPES, 50 mM NaCl, 0,2 mM DTT, 0,01% NaN3, pH 7,5 puffert használtunk. A mintát a kristályosítás előtt 7-10 mg/ml-re koncentráltuk, és 1:1 arányban kevertük 0,1 M nátrium-kakodilát, 12% PEG4000 (w/v), pH 6,1 keverékkel ülő csepp módszerrel, 200 nl-es cseppmérettel 96 lyukú formátumban. Két hét inkubáció után nagy tűszerű kristályokat figyeltünk meg. A Diamond Light Source (UK, Didgot) I03 sugárvonalán végzett távoli adatgyűjtéshez a kristályokat 25% glicerint tartalmazó anyalében áztatva krio-védték, majd N2-ben lefagyasztották a sugárvonalra való szállításhoz. Az adatokat 100 K-en gyűjtöttük 0,9763 Å hullámhosszon, Pilatus3 6M detektorral, 30%-os átviteli teljesítmény, 0,05 s expozíció és 0,1°-os oszcillációs szög alkalmazásával, összesen 2400 képkocka formájában. A diffrakciós adatokat X-ray Detector Software (XDS)54 segítségével integráltuk és skáláztuk. A kezdeti megoldást molekuláris helyettesítéssel kaptuk a PHASER55 segítségével és PDB = 1s0p keresési modellel. Egy aszimmetrikus egységben négy HFD-domént tartalmazó megoldást találtunk, majd a BUSTER56 segítségével végzett többszöri finomítás és a COOT57 segítségével végzett kézi építés jó illeszkedést eredményezett az adatokhoz (lásd az 1. táblázatot). További javulást értünk el az adatok finomításával a transzlációs-liberációs-csavar paraméterek (1/lánc) bevezetésével, a nem-kristályográfiai korlátozások eltávolításával és az egyedi atomi B-faktor modellezésével. A modell végleges Rwork/Rfree értéke 18,6%/23,0% volt, jó általános geometria mellett.

A háromtagú komplex (ADP-aktin, egér CAP1 HFD doménje és egér twinfilin-1 C-terminális ADF-H doménje) kristályosításához az ADP-aktint O/N dialízisben, +4 °C-on, 5 mM HEPES, 0.2 mM MgCl2, 0,2 mM ADP, 0,2 mM EGTA, 0,3 mM glükóz, 0,5 mM β-merkaptoetanol, pH 8,0. A 0,3 mM glükózt és 5 U/ml hexokinázt tartalmazó aktinoldatot Slide-A-Lyser dialízis membránra vittük át, és +4 °C-on lebegtető készülékre helyeztük. Másnap, a komplexképzés előtt az aktint 20 percig 355 040 × g-n centrifugáltuk TLA-120 rotorral. A fehérjéket 1:1,1:1,1:1,1 arányban kevertük (aktin, HFD domén, ADF-H domén), 10-20 mg/ml-re koncentráltuk és a fentiek szerint kristályosításra használtuk. Találatokat kaptunk több különböző körülmények között, és a legjobban diffraktáló kristályt a 0,1 M HEPES, 0,1 mM KCl, 10% PEG4000 (w/v), pH 7,0-ban 1:1 arányban kevert komplex ~10 mg/ml koncentrációjánál kaptuk, 200 nl ülő cseppméret mellett. Az első napon több kis gyémánt alakú kristály jelent meg a cseppben. A harmadik napon egy nagy, rúdszerű kristály jelent meg, míg az összes kis kristály feloldódott. A Diamond Light Source (UK, Didgot) I03 sugárvonalán végzett távoli adatgyűjtéshez a kristályokat LV CryoOilban (MiTeGen) való áztatással krio-védtük, majd N2-ben lefagyasztottuk a szállításhoz. Az adatokat 100 K-en gyűjtöttük 0,9762 Å hullámhossz, Pilatus3 6M detektor, 20%-os átviteli teljesítmény, 0,05 s expozíció és 0,15°-os oszcillációs szög alkalmazásával, összesen 2400 képkocka formájában. A diffrakciós adatokat az XDS54 programmal integráltuk és skáláztuk. A PHASER55 és a PDB = 3daw mint keresési modell segítségével molekuláris helyettesítéssel kaptunk egy kezdeti megoldást, amely egyértelmű extra sűrűséget mutatott az aktin-monomer hegyes végén. Így egy újabb molekuláris cserét végeztünk, és a BALBES58 segítségével a 3daw és 1s0p keresési modellekkel egy kezdeti modellt kaptunk a háromtagú komplexre. Ez egy Q = 0,787 és Rwork/Rfree = 29,7%/35,6%-os megoldást eredményezett. Az aszimmetrikus egység egyetlen 1:1:1:1 HFD:ADF-H:ADP-aktin komplexet tartalmazott. A modell javításához többszöri finomításra volt szükség BUSTER56 segítségével és kézi építésre COOT57 , különösen a D-hurok és a HFD doménben lévő α-hélixek összekötő hurkának újjáépítésére. Végül a vizek hozzáadása, a transzlációs-librációs-csavar paraméterek (1/lánc) bevezetése és az egyedi atomi B-faktor modellezése egy olyan modellt eredményezett, amelynek végső Rwork/Rfree értéke 16,6%/19,4% volt, jó általános geometriával.

A fehérje-fehérje kölcsönhatások vizsgálata gélszűréssel

Az aktin monomer kötődésének vizsgálatához ADP-G-aktint készítettünk a hivatkozásban leírtak szerint. 34. Minden gélszűrési kísérletet +4 °C-on végeztünk 0,5 ml/perc futási sebességgel és 0,5 ml frakcionálással Superdex 200 increase 10/300 GL gélszűrő oszlopon, amelyet 5 mM HEPES, 100 mM NaCl, 0,1 mM ADP, 0,1 mM MgCl2, 1 mM DTT, pH 7,4-ben egyensúlyoztunk. Száz mikroliternyi, 18 µM twinfilin ADF-H domént és 15 µM egyéb fehérjét tartalmazó komplexet injektáltunk az oszlopra és elemeztük az elúciót. A csúcsfrakciókat SDS-PAGE segítségével is elemeztük. Az aktin-monomer versengési kísérleteket a fentiek szerint végeztük, 15 µM C-CAP vagy CARP domén hozzáadásával a mintákhoz. A csúcsfrakciókat SDS-PAGE-n elemeztük, a géleket a ChemiDoc XRS + képalkotó rendszerrel (Bio-Rad) leképeztük, és az Image Lab (Bio-Rad) segítségével számszerűsítettük.

Natív-PAGE

Mini-Protean TGX 10%-os géleket (Bio-Rad) a betöltés előtt 1 órán keresztül hűtött futópufferben (25 mM Tris, 195 mM glicin, 0,5 mM ADP, 0,1 mM MgCl2, pH 8,5) előfuttattuk. A mintákat ADP-aktin dialízis pufferben (5 mM HEPES vagy Tris, 0,1 mM MgCl2, 0,1 mM EGTA, 0,2 mM ADP, 0,3 mM glükóz, 0,1 mM DTT, pH 8.0) az egyes fehérjék 20 µM koncentrációjában, 1:1 arányban összekeverve 2× betöltő pufferrel (20% glicerint, brómfenol-kéket, ADP-t és MgCl2-t nem tartalmazó futópuffer), majd 5 µl térfogatú, 50 µl-es mintatartályokba adagolva. A géleket 100 V-on, jégen futtattuk 4 órán keresztül.

Fluorometrikus aktin filamentumok szétszedésének vizsgálata

Az ADP-aktin filamentumok steady-state szétszedését a következőképpen végeztük: 5 % pirén-aktint polimerizáltunk 20 mM HEPES, 100 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 1 mM ATP, 1 mM DTT, pH 7,4-ben 60 percig. A filamentumok tüskés végeit 50 nM fedőfehérjével fedtük le. Ezt követően 0,5 µM cofilint (és 0,5 µM N-CAP-ot) adtunk hozzá, majd a reakciót 4 µM D-vitamin-kötő fehérje (monomer szekvenáló szer) hozzáadásával indítottuk el. Az aktin végső koncentrációja 2,5 µM volt. Az aktin lebomlását úgy mértük, hogy 2400 másodpercig 22 °C-on, 365 nm-en gerjesztett és 407 nm-en emittált pirén fluoreszcenciát követtünk fluoreszcens spektrofotométeren (Agilent).

CD spektrometria

A CD spektrumokat az N-CAP vad típus, mutánsok és a HFD domén esetében 20 °C-on mértük J-720 spektropolariméterrel (Jasco), 300 µl-es, 0,1 cm fényút-hosszúságú kvarcküvettában, a következő paraméterekkel: folyamatos pásztázó üzemmód 50 nm/perc pásztázási sebességgel, 0,5 nm sávszélesség, 190-260 nm hullámtartomány, 0,5 nm adatosztás. Minden fehérjét 15 µM-ra hígítottunk 10%-os PBS pufferrel. Az egyes fehérjék tíz szkennelésének felhalmozódását egyetlen görbeként ábrázoltuk.

Az atomisztikus MD-szimulációkhoz használt modellek

A cofilinnel díszített aktin modelljei a 3,8 Å felbontású krio-elektronmikroszkópos szerkezeten (PDBID: 5YU8)41 alapultak. A hiányzó hurkokat a RosettaCM59 és RosettaScripts60 segítségével építettük fel az elektronsűrűségtérkép41 jelenlétében, a kapcsolódó helikális szimmetriát előírva. A munka kísérleti konstrukcióinak megfeleltetése érdekében az aktin és a cofilin szekvenciákat ebben a szakaszban a csirkéről nyúlra, illetve egérre cseréltük. Több mint 1000 modellt generáltak. Ezeket ezután összpontszámuk alapján rendeztük, és kiszűrtük azokat, amelyek szerkezeti artefaktumokat (pl. cisz peptidkötéseket) tartalmaztak. A legjobb pontszámot elért három modellből molekuladinamikai (MD) szimulációkat indítottunk (1. kiegészítő táblázat, F1-3 szimulációk).

A HFD-aktin komplexet a kristályosított HFD domén/aktin/twinfilin ADF-H domén komplexből izoláltuk, és külön dokkoltuk a fent leírt kiválasztott, cofilinnel díszített aktin filamentum modellekhez. Ehhez az izolált HFD-aktint szuperponáltuk minden egyes hegyes végű aktin-monomerre, amelyet aztán a HFD-aktinnal helyettesítettünk. Ily módon az aktin-HFD dimer kristályszerkezeti konformációja átkerül a cofilin-díszített aktin csúcsára. A dokkolt modelleket először lokálisan finomítottuk a dokkolási protokoll61 segítségével, majd a Rosetta Software Suite szoftvercsomaggal forgalmazott fast relax62 protokollal visszafogott relaxációt végeztünk. Ezt a folyamatot külön-külön alkalmaztuk az MD-szimulációkhoz kiválasztott minden egyes cofilin-díszített aktin filamentumra (1. kiegészítő táblázat, C1-3 szimulációk).

A hegyes végszelvény felépítése az MD-szimulációkhoz

Minden szimulációt a kiválasztott cofilin-díszített aktin filamentum modelljének egy hegyes végszelvényén végeztünk, amelyet a filamentum tengelyére merőlegesen felszeletelve hoztunk létre. A szeletelés síkját úgy választottuk meg, hogy négy teljes ADP-Mg2+-kötött aktin-monomer és három teljes cofilin-monomer kerüljön a szegmensbe (1. kiegészítő táblázat, F1-3. szimulációk). A szegmens a HFD-hez kötött rendszerekben a hegyes végén lévő két HFD-domént is tartalmazta (1. kiegészítő táblázat, C1-3 szimulációk). A hegyes végű szegmens több polipeptidfragmentumot is tartalmazott cofilinekből és aktinokból a szöges végén (Kiegészítő 5a. ábra). Annak érdekében, hogy a szimulációk során megőrizzük konformációjukat és pozíciójukat, ezeket a töredezett láncokat a szimulációk során végig pozíciósan visszafogottan tartottuk a következők szerint: A hegyes végű szegmens többi részével való határfelületen lévő maradékok egy rétegét szabadon hagytuk; a szeletelés síkjához közeli összes nehézatomot és csak a gerincoszlop nehézatomjait a köztük lévő régiókban 100 kJ/mol/nm2 erőállandóval korlátoztuk (Kiegészítő 5a. ábra). Ezek a részben visszafogott polipeptidtöredékek a tüskés végén platformként működnek a szimulációk során. Ez a megközelítés mind a filamentumszerű fehérje-fehérje határfelületet a szúrós végén, mind a filamentum orientációját fenntartja a szimulációk során.

A maradékok protonáltsági állapotait semleges pH-n a PROPKA363 segítségével végzett pKa számítások alapján határoztuk meg. Minden aktin H73 maradékot metiláltunk (Nτ-metil-l-hisztidin, HIC), és az aktin, a cofilin és a HFD N-terminálisát acetiláltuk. A rendszerek egyes molekuláinak topológiáit az ambertools1864 programmal terjesztett LeAP programmal készítettük el, amelyeket aztán a ParmEd eszközzel GROMACS formátumba konvertáltunk.

A kiválasztott modellekből létrehozott minden hegyes végű szeletet egy hexagonális prizma szimulációs dobozba helyeztünk úgy, hogy a hosszú tengelye a z tengelyhez igazodott. A doboz méreteit úgy választottuk meg, hogy a szál és a doboz minden egyes oldala között legalább 17 Å távolság legyen (1. kiegészítő táblázat). Minden rendszert 0,15 M NaCl oldattal szolváltunk, az ionok számát a rendszer semlegesítéséhez igazítva.

A produkciós futtatások előtt meredek lejtmenet-minimalizálást és egymást követő rövid kiegyenlítő szimulációkat (összesen ~7 ns) végeztünk az NVT és NpT együttesekben a Berendsen termosztát és a barosztát65 segítségével. E kiegyenlítő szimulációk során harmonikus pozíciókorlátozásokat alkalmaztunk a hegyes végszeletre. Az atomok egy kisebb csoportját (az összes nehézatomot, a fehérje gerincét és végül csak a Cα atomokat) minden egyes egymást követő egyensúlyi szimulációban 1000 kJ/mol/nm2 erőállandóval korlátoztuk.

A többi rendszerből elágazó rendszereket (1. kiegészítő táblázat; C1′, C2′. F2′) a megfelelő módosítások elvégzésével (HFD domének dokkolása vagy eltávolítása), az átfedő oldószer-molekulák eltávolításával (ha HFD domének dokkoltak), valamint a dobozméret és az oldószeratomok újbóli beállításával készültek az új rendszermérethez. A szakaszos NVT és NpT kiegyenlítést korlátozásokkal a fent említett módon végeztük el (összesen ~200 ps a szimulációk esetében, ahol a HFD doméneket eltávolítottuk, és összesen ~4 ns, ahol dokkolva van).

Minden előállítási futtatást 1-2-re végeztünk.5 μs-ban az NpT együttesben, csak a platform régióra vonatkozó, fent említett pozíciós korlátozásokkal.

erőtér és paraméterek az MD-szimulációkban

A következő erőtereket és paraméterkészleteket használtuk az MD-szimulációkban: Amber ff14sb66 a fehérjékhez, TIP3P modell67 a vízhez, Joung és Cheatham68 monovalens ion paraméterkészlete a Na+ és Cl-hez, Saxena és Sept69 oktaéderes multiszites ionmodellje a Mg2+-hoz, valamint Meagher et al.70 polifoszforilált vegyület paraméterkészlete az ADP-hez. A metil-hisztidin (Nτ-metil-l-hisztidin, HIC) hiányzó kötésparamétereit a GAFF2 erőtérből64 vettük át. Az atomtöltéseket Duan és munkatársai protokollja szerint számították ki.71 Az R.E.D.III.5 szoftvert72 használták a többalakú, korlátozott elektrosztatikus potenciál (RESP) illesztéséhez a HIC-dipeptid (Ace-HIC-Nme) kiterjesztett és α-hélixes konformációjának felhasználásával. Minden kvantumkémiai számítást a Gaussian09 programcsomag73 segítségével végeztünk a b3LYP/cc-pVTZ elméleti szinten. A töltésszámításokat az IEFPCM modellel végeztük polarizálható kontinuumban, 4-es dielektromos állandóval, az oldószert éterként beállítva.

MD szimulációs protokollok

Minden szimulációt a GROMACS 2018 74 segítségével végeztünk. A mozgásegyenletek integrálása leap-frog algoritmus segítségével történt 2 fs időléptékkel. Minden kötést a LINCS algoritmus75 segítségével korlátoztunk. A szimulációs protokollokat a ref. 66. A nagy hatótávolságú elektrosztatikus kölcsönhatásokat a sima részecskehálós Ewald-sémával76 kezeltük, 0,8 nm-es valós térbeli levágással, 0,12 nm-es Fourier-távolsággal és negyedrendű interpolációval. A van der Waals kölcsönhatásokhoz a Lennard-Jones-potenciált használtuk 0,8 nm-es határértékkel. Hosszú távú diszperziós korrekciókat alkalmaztunk az energiára és a nyomásra77.

Minden termelési szimulációt az NpT együttesben végeztünk. A hegyes végszeletet, a platformot és az oldószert (víz és 0,15 M NaCl) a Nosé-Hoover termosztát78,79 segítségével 310 °K-on, 1,0 ps időállandóval külön hőmérsékletű fürdőkbe kapcsoltuk. Az izotróp nyomáskapcsolást a Parrinello-Rahman barosztát80 segítségével végeztük, 1 atm referencianyomással, 5 ps időállandóval és 4,5 × 10-5 bar-1 összenyomhatósággal.

Az MD-szimulációk elemzése

Minden elemzést VMD81 és házon belüli szkriptek segítségével végeztünk. Az MMGBSA-számításokat az ambertools1864 által forgalmazott MMPBSA.py szoftver82 segítségével végeztük, az Onufriev et al. által kifejlesztett módosított GB-modellt alkalmazva83. 0,15 M sókoncentrációval (100 ns-enként mintavételezett képkockák, az egyes szimulációk első 500 ns-ának elhagyásával).

Szerkezeti elemzések

Az 1d. ábrán bemutatott különböző aktin szerkezetek és konformációs állapotaik elemzéséhez a Tanaka et al41,84 által kidolgozott protokollt követtük. az F-aktin szerkezetet (PDB 6djo) használva referenciaként.

Statisztikai elemzés és reprodukálhatóság

A 2d., 4b. és 4d. ábrán látható adatokat több, különböző napon végzett kísérletből összevontuk, így több független kísérlet adatait képviselik. A 2f, 2g, 2h és 3d táblák egyetlen reprezentatív kísérletből elemzett adatokat mutatnak be. n a 2d, 2f, 2g, 4b és 4d táblák esetében az elemzett szálak számát írja le. n a 6c táblában a kísérlet elvégzésének számának felel meg.

A 2a-d, 3c, 6a-d kiegészítő ábrákon szereplő kísérleteket legalább kétszer végeztük el hasonló eredményekkel. A 3d. ábrán szereplő kísérleteket, a 6a. ábrán szereplő CARP doménverseny-kísérletet és a 7. ábrán szereplő összeszerelést elősegítő körülmények között végzett kísérleteket egyszer végeztük el.

Beszámoló összefoglaló

A kutatás tervezésével kapcsolatos további információk a cikkhez kapcsolódó Nature Research Reporting Summary-ban találhatók.