In vivo RyR1-redukció az izomban core-like myopathiát vált ki

Generation of the RyR1Flox/Flox::HSA-Cre-ERT2 egérmodell

A RYR1 gén 9-11. exonjának mindkét oldalára loxP-helyeket beillesztett egérvonalat (ún. RyR1Flox/Flox) párosítottunk a tamoxifenfüggő Cre-ERT2 rekombinázt a humán vázizom α-aktin gén kontrollja alatt expresszáló HSA-Cre-ERT2 egérvonallal , hogy létrehozzuk a RyR1Flox/Flox::HSA-Cre-ERT2-t. A tamoxifen injekció a Cre-ERT2 rekombináz szelektív aktiválását indukálja a vázizomban, ami a 9-11. exon delécióját és a RYR1 gén megszakítását eredményezi a vázizomban, szigorú tamoxifenfüggőséggel (1a. ábra). Születéskor a RyR1Flox/Flox::HSA-Cre-ERT2 egerek normálisak voltak, és 2 hónapos korukban, amikor már fiatal felnőttek voltak, a rekombinációt tamoxifen injekcióval indukálták (ettől az időponttól kezdve a rekombinált állatokat RyR1-Rec-nek neveztük). A molekuláris és élettani következményeket a továbbiakban az idő függvényében vizsgáltuk, egészen a rekombináció indukcióját követő 105 napig (1b. ábra). A kontroll állatok (CTRL) RyR1Flox/Flox (HSA-Cre-ERT2 transzgén nélkül) tamoxifennel injektált alomtestvérek. A rekombinált egerek általános fenotípusát 75 napos korban a hátsó végtagok abnormális mozgékonyságával és billegő járással társuló kyphosis jellemzi. Az állatok még képesek a hátsó lábukra állni, hogy táplálkozzanak, de a betegség előrehaladtával a táplálékpelleteket szisztematikusan közvetlenül a ketrecbe adták. 105 nap elteltével az állatok még mindig mozgékonyak a ketrecükben, és a CTRL-hez képest nem észleltek megnövekedett elhullási arányt. Mind a hímek, mind a nőstények érintettek voltak. A RyR1 mRNS-szintű relatív mennyiségét a rekombinációt követő 15 naponként RT-q-PCR segítségével elemeztük a quadricepsz izomban a CTRL és a RyR1-Rec állatokban (1c. ábra). A RyR1 mRNS gyors csökkenését figyeltük meg, a kezdeti érték 21% ± 4%-ának megfelelő alacsony és stabil szintet már 3 nappal a tamoxifen beadása után elértük. A rekombináció indukciója után 75 nappal valamennyi vizsgált izomban (Quadriceps, tibialis anterior, EDL, soleus, Additional file 1: S1A ábra) csökkenés volt megfigyelhető. A RyR1 fehérje mennyiségét tovább elemeztük, kvantitatív Western blot segítségével a quadriceps izom homogenátumaiban (1d, e ábra). Ez a mennyiség fokozatosan csökkent, és 105 nap után elérte a kiindulási érték kb. 50%-át. A RyR1 fehérje további csökkenése nem volt megfigyelhető hosszabb idő alatt (az adatok nem láthatóak). A RyR1 fehérje mennyiségét a különböző izomhomogenátokban 75 nappal a rekombinációt követően számszerűsítettük. Minden vizsgált izomban csökkenés volt megfigyelhető, bár a fennmaradó mennyiség kissé különbözött az egyes izmok között, a legmagasabb az interosseusban (64% ± 5%) és a legalacsonyabb a soleusban (33% ± 5%) (Additional file 1: S1B ábra).

A RyR1-Rec egereknél az izom- és testtömeg, valamint az izomerő progresszív csökkenése figyelhető meg

A RyR1-csökkentés következményeit először az egész állat szintjén vizsgáltuk. Kezdetben azonos súly mellett a CTRL állatok súlya lassan, 24,4 ± 0,4 g-ról 30,6 ± 0,8 g-ra nőtt D90-re, míg a RyR1-Rec állatok súlya fokozatosan csökkent D90-re 20,6 ± 1,3 g-ra (2a. ábra). Mind a hímek, mind a nőstények érintettek voltak, és 75 nap után a kezdeti testsúlyuk mintegy 13%-át veszítették el (Additional file 1: S1C ábra). Ez az összes izomban megfigyelt súlycsökkenés eredménye (Additional file 1: S1D ábra). Az általános izomteljesítmény RyR1-csökkentést követő vizsgálatához az állatokat két különböző erőpróbának vetettük alá. Először mind a négy mancsukkal 5 percig lóghattak egy kereszthuzalos felületet megragadva, az esés latenciája az izomerő mértékét tükrözte. A 105 napon keresztül hetente végzett fogásvizsgálat (2b. ábra) azt mutatta, hogy a RyR1-Rec állatok 20-30 nappal a tamoxifen injekció beadása után, amikor a RyR1 mennyisége a kezdeti érték 75-80%-a volt, elkezdtek veszíteni az erejükből, és körülbelül 75 nappal a tamoxifen beadása után már nem tudtak a rácson lógni, mivel a RyR1 mennyisége elérte a 60% körüli szintet. Az izomerőt a gastrocnemius izom 6 perces nem invazív elektrostimulációs protokolljával is értékelték, amelyet anatómiai mágneses rezonanciás képalkotással (MRI) párosítottak általános érzéstelenítésben. A CTRL állatok elektrostimulációs protokollja során 30 nappal a tamoxifen injekció beadása után (2c. ábra, D30) tipikus edzésprofilt rögzítettünk, stabil kezdeti izomerővel, amely az izom kifáradásával lassan csökkent. A CTRL-csoportban D60 és D90 időpontban a mozgásprofil az állatok öregedésével javuló izomerőt mutatott (2c. ábra). Ezzel szemben a RyR1-Rec állatok teljesítménye, hasonlóan a CTRL-hez D30-ban, az életkor előrehaladtával romlott. A RyR1-Rec állatok D90-ben már nem tudták elvégezni a gyakorlatot (2c. ábra, RyR1-Rec D90). Az MR-felvételek segítségével mért gastrocnemius térfogat (2d. ábra) a CTRL állatokban stabil maradt D30-tól (161 ± 5 mm3 ) D90-ig (164 ± 4 mm3 ). Ezzel szemben a RyR1-Rec egerekben a gastrocnemius térfogata D30-tól kezdve szignifikánsan kisebb volt, mint a CTRL egerekben (141 ± 3 mm3, p = 0,003), és tovább csökkent 100 ± 3 mm3 -re D60-ra (p < 0,001 az azonos korú CTRL-hez képest) és 69 ± 4 mm3 -re D90-re (p < 0,001 az azonos korú CTRL-hez képest). A maximális specifikus rángási feszültség (izomtérfogatra normalizált abszolút rángási feszültség) megerősíti, hogy mindkét csoport hasonló izomerővel rendelkezett D30-ban (2e. ábra), de a RyR1-Rec állatok ereje drámaian csökkent, míg a CTRL állatoké nőtt az életkor előrehaladtával. Ezenkívül a gastrocnemius izom bioenergetikájának változásait az elektrostimuláció során noninvazív módon, in vivo 31-foszfor (31P) MR-spektroszkópiával értékeltük D60-ban. Míg a bazális intramiofibrilláris pH nem különbözött a két csoport között (Additional file 1: S2A ábra), az acidózis mértéke az edzés végén alacsonyabb volt (p = 0,016) a RyR1 Rec állatokban (Additional file 1: S2B ábra), ami arra utal, hogy ezekben az állatokban csökkent a glikolitikus fluxus az edzett izomban. Ezenkívül az edzés utáni foszfokreatin reszintézis időállandója (τPCr) szignifikánsan rövidebb volt (p = 0,047) a RyR1-Rec egerekben (Additional file 1: S2C, D ábra), ami a jobb in vivo mitokondriális funkciót tükrözi. Valóban, a PCr-szintézis az edzés utáni regenerációs időszakban kizárólag az oxidatív ATP-szintézisre támaszkodik, így a τPCr az oxidatív foszforilációs kapacitás indexének tekinthető . Összességében ezek az eredmények azt mutatják, hogy a RyR1 progresszív csökkentése progresszív súlycsökkenéssel és az izomerő csökkenésével jár.

A RyR1-Rec egerekben az izolált rostok fiziológiai tulajdonságai károsodtak

Az izomfunkció megváltozását tovább jellemeztük az egyes izomrostok szintjén a teljes sejtfeszültség-clamp és a konfokális képalkotás kombinációjával . A T-tubulus hálózatot a plazmamembrán di-8-anepps festésével képezték le. A CTRL és RyR1-Rec rostok között nem észleltünk minőségi különbséget a hálózatban (3a. ábra, balra) vagy mennyiségi különbséget az átlagos T-tubulus sűrűségben, az átlagos nyugalmi szarkomer hossz enyhe, de jelentős rövidülése mellett (3a. ábra, jobb oldali grafikonok). A DHPR-en keresztüli feszültség-aktivált Ca2+-beáramlást (3b-d. ábra) és a RyR1-en keresztüli Ca2+-felszabadulási fluxust (3e-i. ábra) egyidejűleg vizsgáltuk. A CTRL rostokhoz képest a RyR1-Rec rostok feszültség-aktivált DHPR Ca2+ áramot mutattak hasonló időbeli lefolyással (3b. ábra), de csökkent sűrűséggel, amint azt a két csoportban az áramsűrűség csúcsértéke a feszültség függvényében mutatja (3c. ábra), ami a maximális konduktancia (Gmax) 30%-os csökkenését jelentette, az áram és a feszültség kapcsolat egyéb paramétereinek ehhez társuló változása nélkül (3d. ábra). Az SR Ca2+ felszabadulásának feszültségfüggését a Ca2+-érzékeny festék, a rhod-2 vonalas képalkotásából vizsgáltuk. A RyR1-Rec rostokból származó line-scan képek minőségileg hasonlóak voltak a CTRL rostokból származó képekhez (3e. ábra), a fluoreszcencia gyors emelkedését mutatták a T-tubulus membrán depolarizációjára, térben homogénen a szkennelt vonal mentén. Az SR Ca2+ felszabadulás sebessége (3g. ábra), amelyet a növekvő amplitúdójú depolarizációs impulzusok által kiváltott rhod-2 fluoreszcencia változásaiból számítottunk (3f. ábra), hasonló időbeli lefolyást mutatott a RyR1-Rec rostokban, mint a CTRL rostokban, de fontos, hogy a csúcsértékek csökkentek a RyR1-Rec-ben. Az SR Ca2+ felszabadulás csúcssebességének illesztése a feszültség függvényében (3h ábra – felső grafikon) azt mutatta, hogy a Ca2+ felszabadulás maximális sebessége 25%-kal csökkent a RyR1-Rec csoportban (3i, Max ábra), a meredekségi tényező (k) is enyhén, de jelentősen csökkent, míg a középaktivációs feszültség (V0,5) nem változott. A RyR1-Rec rostokban (3h. ábra, alsó grafikon) az SR Ca2+ felszabadulás csúcsértékig eltelt idejének enyhe (átlagosan 1,3 ms), de szignifikáns növekedése volt megfigyelhető. A rostok citoszolikus Ca2+ eltávolítási képességében (SERCA pumpafunkció), amelyet az alacsony affinitású Ca2+-érzékeny fluo-4 FF festékkel mértünk nem-EGTA-pufferelési körülmények között, nem észleltünk változást (Additional file 1: S3 ábra). Összességében ezek az eredmények azt mutatják, hogy a RyR1 mennyiségének 35%-os csökkenése az interosseusban a DHPR-en keresztüli kalciumáram 30%-os csökkenésével és a RyR1-en keresztüli kalciumáram 25%-os csökkenésével jár együtt.

A RyR1 csökkenése befolyásolja a vázizomzat szerkezetét

A RyR1 csökkenésével járó ezen funkcionális változások alapjainak jobb megértése érdekében az izomszerkezetet RyR1-Rec állatokon vizsgáltuk a rekombinációt követő D75-ös időpontban, és összehasonlítottuk a CTRL állatokkal. Az Extensor digitorum longus (EDL), egy gyors rángású izom, a soleus, egy lassú rángású izom és a tibialis anterior (TA), egy vegyes izom elemzését hematoxilin-eozin, NADH és Gomori trikróm festésekkel végeztük. A 4a. ábrán bemutatott TA-festések a RyR1-Rec állatokban rendellenes izomszerkezetet mutatnak, fibrosis vagy központi magok nélkül, de rostsorvadással, amely mind az I., mind a II. típusú rostokat érinti (2. táblázat). A mitokondriumok dezorganizációja, amelyet ugyanazon rost szomszédos régióiban helyi felhalmozódás/elhalványulás jellemez (nyílhegy és a 4a. ábra betétje), valamint a Gomori-trikriklómmal megfigyelt vörös festékfelhalmozódás (Additional file 1: Fig. S4) is megfigyelték, amely hasonlít a betegeknél nemrégiben leírt poros magokra. Az EDL-ben mindkét rosttípusban rostsorvadást figyeltek meg, bár a csökkenés az I-es típusú rostokban kissé jelentősebb volt (2. táblázat). A CTRL és RyR1-Rec egerek transzverzális TA metszetét RyR1 és desmin elleni antitestekkel festették meg. A RyR1-Rec TA szelvényekben nem volt megfigyelhető változás az I. és II. típusú rostok közötti RyR1-eloszlásban, ami hasonló RyR1-csökkenésre utal minden rosttípusban (4b. ábra). Meglepő módon a desmin eloszlásában jelentős módosulást figyeltünk meg, a kis I-es típusú rostokban nagymértékű növekedéssel (4b. ábra): a CTRL TA metszetekben minden rost hasonló perifériás festődést mutatott, míg a RyR1-Rec TA metszetekben a kis I-es típusú rostok mind a rostperiférián, mind a citoszolban erősen festettek voltak (4b. ábra). Bár az IF-jelölés nem kvantitatív, ezek az eredmények azt mutatják, hogy a RyR1-redukció valószínűleg homogén volt, anélkül, hogy a szomszédos rostok között hatalmas különbség lett volna, mint a desmin esetében megfigyelhető, a Western blottal végzett kvantitatív meghatározás az egyes rostokban található fehérje tükrözése, és nem a 0% RyR1-et tartalmazó rostok és a 100% RyR1-et tartalmazó rostok átlaga ugyanazon az izmon belül.

Az izolált EDL rostok immunfluoreszcens jelölésével tovább vizsgáltuk a triádok szerveződését (5a. ábra). Az alfa-aktinin (mint a Z-vonal markere), a triadin és a RyR1 (mint triádmarkerek) jelölése a RyR1-Rec EDL rostokon azt mutatta, hogy a RyR1 mennyiségének csökkenése a rost általános dezorganizációját eredményezte, a triádok abnormális lokalizációjával és a Z-vonal megszakításával, de a triadin és a RyR1 még mindig részben kolokalizálódott. Bár a triádok a Z-vonal mindkét oldalán megmaradtak, a Z-vonal nem alkotott egyenes vonalat, mint a CTRL-ben, hanem számos mikro-megszakadást mutatott (5a. ábra mellékelve). Az izom ultrastruktúráját elektronmikroszkópiával elemeztük a RyR1-Rec EDL rostokon D75-ben (5b. ábra). Egyes régiók viszonylag megőrzött struktúrával rendelkeztek (5b. ábra, bal oldali rost), míg néhány szomszédos régió erősen dezorganizált volt, a szarkomerek szabályos szerveződésének zavarával, a mitokondriumok dezorganizációjával és számos membránköteg jelenlétével (5b. ábra, nyilak, nagyítva a betétben), amelyeket korábban többszörös triádoknak neveztek . E többszörös triádok morfológiai jellemzőit a normális szimpla triádokhoz képest a 3. táblázat mutatja be, további példák pedig az 1. kiegészítő fájlban találhatók: S5 ábra. A feltételezett T-tubulus szélességének, a feltételezett SR szélességének és az intermembrán (T-tubulus/SR) térnek a pontos számszerűsítése (Additional file 1: S5 ábra) a T-tubulus átlagos méretének hatalmas növekedését mutatta ki ezekben a többszörös triádokban (kétszeres növekedés, elérve a normál triádban a T-tubulus méretének 202%-át), míg az SR átlagos szélessége csak kis mértékben nőtt (+ 10%), és az intermembrán tér nem változott. Ezek az eredmények a RyR1-Rec egerek izomzatának általános strukturális dezorganizációjára utalnak, amely a membránok átalakulásával jár együtt.

A RyR1 redukció számos fehérje mennyiségének módosításával jár

A RyR1 redukció következményeit molekuláris szinten kvantitatív Western blot segítségével vizsgáltuk a quadriceps izomban CTRL vagy RyR1-Rec egerek (minden csoportban 8 állat) tamoxifen injekciót követő D75-ös időpontban (ábra. 6). A kalciumkezelésben közvetlenül vagy közvetve részt vevő számos fehérje relatív mennyiségét becsültük meg, referenciaként a fehérjék festékmentes értékeléssel meghatározott teljes mennyiségét használva . A RyR1 mennyiségi meghatározásában nem tapasztaltunk különbséget e módszer és a miozin nehézlánc referenciafehérjeként való használata között (1., 6. ábra összehasonlítása). A T95 triadin izoforma, a CSQ1 kalciumkötő fehérje, a CSQ1, a Ca2+-ATPáz SERCA, a mitokondriális FoF1-ATPáz és a DHPR alfa-1 alegységének mennyiségében nem észleltünk jelentős változást a CRTL és a RyR1-Rec izmok között (6a, b ábra). Ezzel szemben növekedés volt megfigyelhető az STIM1 (× 3,7 ± 1, p = 0,02), a triadin T51 izoforma (× 1,6 ± 0,1, p < 0,001), a CLIMP63 (× 1,8 ± 0,2, p = 0,004) és az ORAI1 (× 3,7 ± 1, p = 0,017) mennyiségében. Mivel immunfluoreszcens jelöléssel a desmin strukturális fehérje lokalizációjának módosulását figyeltük meg (5b. ábra), a desmin expressziós szintjét is számszerűsítettük, és a desmin mennyiségének hatalmas növekedését tapasztaltuk (× 8,2 ± 1,2, p = 0,001). A CLIMP63 és STIM1 lokalizációját a RyR1-Rec EDL rostokban immunfluoreszcens jelöléssel elemeztük, és nem észleltünk jelentős módosulást (Additional file 1: S6 ábra). Ezért a RyR1 fehérje csökkenése a kalciumszabályozásban vagy az izomarchitektúrában szerepet játszó különböző fehérjék növekedésével járt együtt.

Autofágia megváltozik a RyR1 csökkenése következtében

Az autofágia megváltozását figyelték meg néhány myopathiában . A RyR1-redukciót követő izomsorvadáshoz vezető mechanizmusok azonosítása érdekében RyR1-Rec izmokban az autofágia fluxusban bekövetkező változásokat kerestük. Az LC3 II, az autofágoszómák membránfehérjéjének mennyiségét kvantitatív Western blot segítségével értékeltük (7a, b ábra), és az LC3 II növekedését figyeltük meg (172% ± 32%, p = 0,03). Az autofagoszómák e növekedése vagy az autofagoszómák képződésének növekedését (az autofágia folyamatának növekedése miatt), vagy a lizoszómákkal való fúziójuk csökkenését (és ezáltal az autofágia degradációjának gátlását) tükrözheti. Az autofágia fluxus módosulásának pontos természetét tovább elemeztük a p62, egy jól ismert, kifejezetten autofágia útján lebomló fehérje mennyiségi meghatározásával, amelynek mennyisége szintén jelentősen megnőtt (7a, b ábra, 172% ± 22%, p = 0,006). Az LC3 II és a p62 ezzel összefüggő növekedése a RyR1-Rec izomban a kontrollhoz képest azt sugallta, hogy a RyR1 csökkentése tehát az autofágia-áramlás gátlásával járt együtt. Ezenkívül az autofágia két gátlója, az mTOR és az S6 fehérje aktivációjának (foszforilációjának) növekedése (7b, c ábra) volt megfigyelhető (P-mTOR/mTOR növekedés 174% ± 17%, p = 0,01; P-S6/S6 növekedés 320% ± 50%, p < 0,001). E két autofágia-inhibitor foszforilációjának növekedése a RyR1-Rec állatokban a kontrollokhoz képest tovább mutatott arra, hogy az autofágia gátlása felelős az izomsorvadásért a RyR1-Rec állatokban.

A humán betegek biopsziáiban a RyR1-Rec egerekben megfigyeltekhez hasonló defektusok figyelhetők meg

A közelmúltban egy recesszív veleszületett myopathiában szenvedő betegek nagy kohorszán végzett vizsgálatban , a RyR1 mennyiségének csökkenésével járó betegek több mint felében atipikus struktúrák, úgynevezett “poros magok” jelenlétét azonosítottuk. Ezeket többszörös festéssel figyeltük meg, és a klasszikus központi magtól (oxidatív festéstől mentes, jól definiált régiók) a rosszul definiált határok, a fokális myofibrilláris dezorganizáció, a Gomori-trikróm festésnél vöröses-lilás szemcsés anyaglerakódás és az oxidatív festésnél csökkent vagy/és fokozott enzimatikus aktivitású kevert terület révén különböznek (Additional file 1: S7 ábra). Ezek a szerkezeti változások tükrözik az egérmodellünkben megfigyelt módosításokat (4. ábra és Additional file 1: S7 ábra). Ezért tovább hasonlítottuk össze az új egérmodellünket és a RyR1 fehérje csökkenésével és “poros magokkal” rendelkező betegekből származó izombiopsziákat. Kvantitatív Western blot segítségével megbecsültük az egérmodellünkben egyértelműen módosított fehérjék mennyiségét 5 recesszív Dusty Core betegségben (két RyR1 mutáció RyR1 fehérje csökkenést eredményez – 8a. ábra) szenvedő betegben is. Referenciaként különböző korú (3,5 és 64 év közötti) kontroll biopsziákat használtunk. A RyR1 fehérje nagymértékű csökkenése volt megfigyelhető minden betegnél (átlagos expressziós szint 19,8% ± 2,2% a CTRL-hez képest, p < 0,001). Ezenkívül a CLIMP63 és a desmin növekedését is megfigyelték. A RyR1 csökkenése a CLIMP63 jelentős növekedésével járt együtt (átlagos expressziós szintnövekedés ötszörösére, 516% ± 220%). Ezenkívül a desmin expressziós szintje is drasztikusan megnőtt a betegeknél a kontrollhoz képest (átlagos expressziós szintnövekedés 240-szeresére, 24 170% ± 7 635%). Elektronmikroszkópos vizsgálatot alkalmazva a betegek biopsziájának ultrastruktúrájának elemzésére, minden betegnél számos membránköteg volt megfigyelhető a dezorganizált régiókban (8c. ábra, nyilak). Ezek a régiók, hasonlóan a RyR1-Rec izomban megfigyelt halmokhoz (4b. ábra), egy közös mechanizmusra utaltak, mind az egerekben, mind az emberben, amely e struktúrák kialakulásához vezet a RyR1-redukció eredményeként. A Dusty Core betegségben szenvedő betegekével megegyező módosítások mellett ez a modell tehát releváns modellt képez a patofiziológiai mechanizmusok tanulmányozására.