Fluoreszcens antitest technikák

Benedette Cuffari, M.Sc.Reviewed by Emily Henderson, B.Sc.

Eredeti, 1942-es felfedezése óta az immunfluoreszcens festés rendkívül megbízható és hatékony technika maradt a kutatási és diagnosztikai célok széles körében.

Fluoreszcens molekulákkal jelölt leukémiás sejtek. Image Credit: Vshivkova/.com

A fluoreszcens antitest (FA) technikák során általában olyan sejteket vagy antitestet használnak, amelyek állandó régióját fluoreszcens jelöléssel, más néven fluorofórral látták el. Az FA technikákat gyakran közvetlen vagy közvetett kategóriákba sorolják.

Direkt fluoreszcens antitest

A közvetlen fluoreszcens antitest technika, amelyet egyébként közvetlen immunfluoreszcenciának (DIF) is nevezhetünk, egyetlen fluoreszcensen jelölt elsődleges antitest használatát jelenti, amelyet egy célantigénhez való kötődésre használnak. Klinikai alkalmazásakor a DIF különösen hasznos az olyan bakteriális betegségek gyors diagnosztizálására, mint a Streptococcus pyogenes, amely közismertebb nevén streptococcus, valamint a Mycoplasma pneumoniae és a Legionella pneumophilia fajok által okozott tüdőgyulladás.

Az ilyen diagnosztikai célokra a beteg mintáját először egy mikroszkópos tárgylemezre helyezik, majd a fluoreszcens antitestnek teszik ki. A fluoreszcens jelölésű antitest és a célantigén – ami ezekben a helyzetekben baktériumok lennének – közötti bármilyen kötődés hatására ezek az anyagok fluoreszcens mikroszkóppal történő vizsgálat során megvilágosodnak.

A DIF-et a diagnosztikai eszközként való alkalmazásán túlmenően széles körben használják tudományos kutatási vizsgálatokhoz is. Ilyen célokra egy fagyasztott szövetmintát, amelyet 5 vagy 6 mikrométeres (µm) vékony metszetekre vágtak, üveglemezre helyeznek.

A tárgylemezeket ezután fluoreszcens jelölésű antitesttel inkubálják, amely jellemzően az IgA, IgG és IgM antitest izotípusok ellen irányuló antitestek panelét tartalmazza, a 3. komplementtel együtt, amely az adott antigén ellen irányul.

Megjegyzendő, hogy az ilyen típusú vizsgálatokhoz használt antitest koncentrációja olyan korábbi kísérleteken alapul, amelyek megerősítették, hogy melyik koncentrációval lehet a legnagyobb jel-háttér arányt elérni.

A tárgylemezek legalább 30 perces sötétben és szobahőmérsékleten történő inkubálása után a tárgylemezeket lemossuk, majd fluoreszcens mikroszkóppal képet készítünk róluk.

Image Credit: anyaivanova/.com

Indirekt fluoreszcens antitest

A DIF esetében alkalmazott egylépéses technikával szemben az indirekt IF (IIF) vagy indirekt FA (IFA) kétlépéses folyamat, amely egy nem jelölt elsődleges ellenanyag mintára történő felvitelével kezdődik, amely egy célantigén ellen irányul. Az IIF második lépése egy fluoreszcensen jelölt másodlagos antitest használatát jelenti, amely az elsődleges antitest Fc-része ellen irányul.

Noha az IIF-et bonyolultabbnak tartják, mint a DIF-et, mivel hosszabb időt vesz igénybe, és két kompatibilis antitest használatát igényli, érzékenységi képességei tekintetében jobbnak tekinthető.

Az IFA-tesztek néhány gyakori klinikai alkalmazása közé tartoznak a szifilisz diagnózisára használt tesztek. Az IFA-teszt ezen típusához a korábban egy kutatóállatból izolált T. palladium sejteket izolálják és egy üveg tárgylemez felületére helyezik. Ezután egy pácienstől nyert szérumot terítenek a T. palladium sejtekre, hogy az anti-treponémiás antitestek, ha vannak, kötődjenek a rögzített antigénekhez.

A páciens szérummintájának kimosása után egy fluorofórral jelölt másodlagos antitestet adnak hozzá. A pozitív szifiliszeredmény megvilágítja az összes másodlagos antitest-fluorofór konjugátum komplexet.

A másik, klinikai környezetben széles körben alkalmazott IFA-típus az, amelyet a szisztémás lupus erythematosus (SLE) diagnózisára használnak. Az SLE-ben, azaz autoimmun betegségben szenvedő betegeknél megnő a keringő antinukleáris autoantitestek (ANA) szintje, amelyek mind a DNS, mind a DNS-hez kötődő különböző fehérjék ellen irányulnak.

Az IFA-vizsgálat ezen típusához a sejteket tenyésztik, majd üveglemezre helyezik. Ezután minden egyes tárgylemezt a beteg ellenanyagának különböző koncentrációjával inkubálnak, majd a nem kötött fehérjék eltávolítása érdekében átmossák őket.

A mosási lépés után fluoreszcensen jelölt másodlagos ellenanyagot – amely az ANA-teszt esetében antihumán IgG lesz – adnak a tárgylemezekhez, és hagyják őket inkubálni. Ezután a szérumban lévő ANA titerét a legmagasabb szérumhígításból nyerik, amely fluoreszcenciát mutatott, és ezt használják az SLE diagnózis meghatározására.

Áramlási citometria

A fluoreszcens antitest-technika harmadik típusa az áramlási citometria, amely egy automatizált sejtszámláló rendszer, amely az olyan összetett keverékekben, mint a vér vagy a szérum, jelen lévő specifikus sejtek számszerűsítésére használható.

A tipikus áramlási citometriás kísérlet egy fluoreszcensen jelölt antitest inkubálásával kezdődik, amely a sejtek egy adott alpopulációja ellen irányul, mint például az anti-CD4, amely képes kötődni a CD4 glikoproteinhez, amely a különböző immunsejtek, köztük a T-helper sejtek, monociták és makrofágok felszínén található. Az áramlási citometriával több sejttípus jelenléte is számszerűsíthető a megfelelő sejtkészítők használatával.

Az inkubáció befejezése után a mintát az áramlási citométerbe vezetik. Ebben a készülékben egy keskeny kapilláris kényszeríti a mintában lévő sejteket, hogy egy sorban haladjanak át rajta. Ahogy a sejtek áthaladnak a kapillárison, egy lézer aktiválja és gerjeszti a fluorofórral megjelölt sejteket.

Az egyes gerjesztett sejtek fluoreszcencia-intenzitását ezután az előre- és oldalszórásos detektorok mérik, és az elemzéshez egy hisztogramon ábrázolják. A számszerűsítési célokon kívül mind az áramlási citometria, mind az immunfluoreszcencia használható a sejtek kutatási célú, tisztított alpopulációkba történő válogatására a fluoreszcencia-aktivált sejtválogató (FACS) néven ismert technikával.

• Odell, I. D., & Cook, D. (2013). Immunfluoreszcens technikák. Journal of Investigative Dermatology 133. doi:10.1038/jid.2012.455.
• Parker, N., Schneegurt, M., Tu, A. T., et al. (2016). 20.5. fejezet Fluoreszcens antitest technikák. In: Microbiology. Hozzáférés: https://openstax.org/books/microbiology/pages/20-5-fluorescent-antibody-techniques.
• Betterle, C., & Zanchetta, R. (2012). Az immunfluoreszcens technikák az endokrin autoimmun betegségek diagnosztikájában. Autoimmunity Highlights 3(2); 67-78. doi:10.1007/s13317-012-0034-3.

További olvasmányok

• Minden antitest tartalom
• VHH antitestek (nanobodies) előnyei és korlátai
• Az antitestek szelekciója DNS origami állványzat segítségével
• A hiszton-deacetiláz (HDAC) antitestek felhasználása in Kutatás
• Az antitestek felhasználása a Parkinson-kór kutatásában

Az író

Benedette Cuffari

Miután 2016-ban elvégezte a toxikológia alapszakot, két mellékszakkal, spanyol és kémia szakon, Benedette folytatta tanulmányait, és 2018 májusában elvégezte a toxikológia mesterszakot. A doktori iskola alatt Benedette a mekloretamin és a bendamusztin dermatotoxicitását vizsgálta; két nitrogénmustáros alkiláló hatóanyagot, amelyeket a rákellenes terápiában használnak.

Hivatkozások