Célkitűzések:

1. A baktériumok két fő kategóriájának megkülönböztetése: Gram-pozitív és Gram-negatív baktériumok.
2. A Gram-festési reakció hatásának megértése a Gram-pozitív és Gram-negatív baktériumokra a sejtfaluk biokémiai és szerkezeti különbségei alapján.

Kattintson az animáció megtekintéséhez

A tartás a mikroszkópos technikákban használt segédtechnika, amelyet a mikroszkópos kép tisztaságának növelésére használnak.A festékeket és színezékeket széles körben használják a tudományban a biológiai minták, sejtek, szövetek stb. szerkezetének kiemelésére.

A mikrobiológiában leggyakrabban használt festési eljárás a Gram-festés, amelyet Hans Christian Joachim Gram dán tudós és orvos fedezett fel 1884-ben. A Gram-festés egy differenciális festési eljárás, amely a baktériumokat két csoportra különbözteti meg: Gram-pozitív és Gram-negatív baktériumokra. Az eljárás azon alapul, hogy a mikroorganizmusok mennyire képesek megtartani a gramfestés során használt festékek színét. A gram-negatív baktériumokat az alkohol elszínteleníti, elvesztve az elsődleges festék színét, a lilát. A Gram-pozitív baktériumokat az alkohol nem színteleníti el, és lila színűek maradnak. A színtelenítési lépés után egy ellenfestéket használnak, amely rózsaszín színt kölcsönöz a színtelenített gram-negatív szervezeteknek.

Ábra: Hans Christian Joachim Gram

A Gram-festés jelentősége:

A Gram-festés nagyon fontos előzetes lépés a baktériumok kezdeti jellemzésében és osztályozásában. A baktériumok festési jellemzők alapján történő azonosításában is kulcsfontosságú eljárás, amely lehetővé teszi a baktériumok fénymikroszkópos vizsgálatát. A festetlen kenetben lévő baktériumok fénymikroszkóppal vizsgálva láthatatlanok. A festést követően a baktériumok morfológiája és elrendeződése is megfigyelhető. Ezenkívül fontos lépés a fertőző ágensek szűrésében is a klinikai mintákban, például a betegből vett közvetlen kenetekben.

A Gram-festési eljárás lehetővé teszi, hogy a baktériumok a sejtfal kémiai és fizikai tulajdonságainak különbségein alapuló festékek színét megtartsák.

1. A Gram-festési eljárásnak köszönhetően a baktériumok a sejtfal kémiai és fizikai tulajdonságainak különbségein alapulva megtartják a festékek színét. Gram-pozitív baktériumok: Sötétlilára foltozódnak, mivel a kristályibolya nevű elsődleges festékanyagot megtartják a sejtfalban.

Példa:

Ábra: Gram-pozitív baktériumok

2. Gram-negatív baktériumok: A Safranin nevű ellenfestő festék visszatartása miatt vörös vagy rózsaszínűre színeződnek.

Példa: Escherichia coli

Ábra: Gram-negatív baktériumok

Baktériumok morfológiája:

A baktériumok nagyon kicsi egysejtű mikroorganizmusok, amelyek mindenütt jelen vannak a természetben. Méretük mikrométeres (1µm = 10-6 m). Sejtfaluk peptidoglikánból áll, és bináris osztódással szaporodnak. A baktériumok morfológiai jellemzőikben különböznek.

A leggyakoribb morfológiák:

Coccus (pleurális: Cocci):

Gömb alakú baktériumok; előfordulhatnak párban (diplococcusok), négyes csoportokban (tetracocusok), szőlőszerű csomókban (Staphylococcusok), láncokban (Streptococcusok) vagy nyolc vagy több egyedből álló kocka alakú elrendeződésben (sarcinae).

pl: Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes

Bacillus (pleurális: Bacillusok):

Rúd alakú baktériumok; általában egyesével fordulnak elő, de esetenként párban (diplo-bacillusok) vagy láncokban (streptobacillusok) is előfordulhatnak.

Pl: Bacillus cereus, Clostridium tetani

Spirillum (pleurális: Spirilla):

Spirál alakú baktériumok

Pl: Spirillum, Vibrio, Spirochete fajok.

Egyes baktériumok más alakúak, például:

Kokobacillusok: Hosszúkás gömb vagy tojásdad forma.

Fonalas: Hosszú láncokban vagy szálakban előforduló bacillusok.

Fusiform: Kúpos végű bacillusok.

Ábra: Különböző baktériummorfológiák

Gram-festési mechanizmus:

Gram-pozitív sejtfal:

Gram-pozitív baktériumoknak vastag, hálószerű sejtfaluk van, amely peptidoglikánból áll (a sejtfal 50-90%-a), amely lilára festődik. A peptidoglikán főként egy poliszacharid, amely két alegységből, az N-acetil-glükozaminból és az N-acetil- muraminsavból áll. Ahogy a peptidoglikán egymás melletti rétegei kialakulnak, egy transzpeptidáz enzim segítségével rövid peptidláncok kötik őket keresztbe, ami a sejtfal alakját és merevségét eredményezi. A Gram-pozitív organizmusok vastag peptidoglikán rétege lehetővé teszi, hogy ezek az organizmusok megtartsák a kristályibolya-jód komplexet, és lilára festik a sejteket.

A liptoteichonsav (LTA) a Gram-pozitív baktériumok sejtfalának másik fő alkotóeleme, amely a peptidoglikán rétegbe ágyazódik. Teichoesavakból áll, amelyek hosszú ribitol-foszfátláncok, amelyek egy glicerid segítségével a lipiddupla réteghez rögzülnek. Az autolitikus falenzimek (muramidázok: A sejtfalban található bakteriális enzimek, amelyek sérülést vagy elhalást követően a sejt szétesését okozzák.)

A Gram-pozitív sejtfal orvosi jelentősége:

Az LTA antigén tulajdonságokkal is rendelkezik, amelyek specifikus immunválaszt stimulálnak, amikor a sejthalált követően felszabadul a sejtfalból. A sejthalál mailnlyan a lizozimális aktivitás, a leukocitákból származó kationos peptidek vagy béta-laktám antibiotikumok által kiváltott lízis miatt következik be.

Gram-negatív sejtfal:

Agram-negatív baktériumok peptidoglikán rétege vékonyabb (a sejtfal 10%-a), és az alkoholos öblítéssel történő elszíntelenítés során elveszítik a kristályibolya-jód komplexet, de megtartják a Safranin ellenfestéket, így vöröses vagy rózsaszínűnek tűnnek. Rendelkeznek még egy lipideket tartalmazó külső membránnal is, amelyet periplazmatikus tér választ el a sejtfaltól.

A Gram-negatív sejtfal orvosi jelentősége:

A Gram-negatív baktériumok sejtfala gyakran virulenciafaktor, amely lehetővé teszi a patogén baktériumok számára, hogy betegséget okozzanak. A Gram-negatív baktériumok virulenciája gyakran a sejtfal bizonyos összetevőihez, különösen a lipopoliszacharidhoz ( más néven LPS vagy endotoxin) kapcsolódik. Az emberben az LPS veleszületett immunválaszt vált ki, amelyet citokintermelés és az immunrendszer aktiválása jellemez. A citokintermelés következtében gyulladás lép fel, amely a gazdaszervezet toxicitását is előidézheti.

Stain reakció:

A Gram-festés négy alapvető lépése:

1) Az elsődleges festék kristályviola (CV) alkalmazása a baktériumtenyészet hőfixált kenetére.

A CV vizes oldatban CV+ és Cl – ionokra disszociál. Ez a két ion ezután áthatol mind a Gram-pozitív, mind a Gram-negatív sejtek sejtfalán és sejtmembránján. A CV+ ionok később kölcsönhatásba lépnek a negatív töltésű baktériumkomponensekkel, és lilára festik a baktériumsejteket.

2) Gram-jód hozzáadása.

A jód (I – vagy I3 -) pácanyagként és csapdázóként működik. A pácanyag olyan anyag, amely növeli a sejtfal festékkel szembeni affinitását azáltal, hogy az elsődleges festékhez kötődik, és így oldhatatlan komplexet képez, amely a sejtfalban csapdába esik. A Gram-festési reakcióban a kristályviola és a jód oldhatatlan komplexet (CV-I) képez, amely a kenet sötétlila színűvé tételére szolgál. Ebben a fázisban minden sejt lilává válik.

3) Színtelenítés 95%-os etil-alkohollal.

Az alkohol vagy aceton feloldja a Gram-negatív baktériumok lipid külső membránját, így a peptidoglikán réteg szabadon marad, és növeli a sejtfal porozitását. A CV-I komplex ezután kimosódik a vékony peptidoglikán rétegből, így a Gram-negatív baktériumok színtelenek maradnak.

Másrészt az alkohol dehidratáló hatással van a Gram-pozitív baktériumok sejtfalára, ami a sejtfal pórusainak zsugorodását okozza. A CV-I komplex szorosan kötődik a többrétegű, erősen keresztkötésű Gram-pozitív sejtfalba, így a sejtek lilára színeződnek.

A színtelenítési lépést óvatosan kell elvégezni, különben túlságosan elszíneződhet. Ez a lépés kritikus, és helyesen kell időzíteni, különben a kristályviola festék eltávolodik a Gram-pozitív sejtekről. Ha a színtelenítőszert túl hosszú ideig alkalmazzák a sejtre , a Gram-pozitív szervezetek Gram-negatívnak tűnnek. Alulszíneződés akkor következik be, ha az alkoholt nem hagyjuk elég ideig hatni ahhoz, hogy a CV-I komplexet kimossuk a Gram-negatív sejtekből, aminek következtében a Gram-negatív baktériumok Gram-pozitívnak tűnnek.

4) Ellenfestés szafraninnal

A színtelenített Gram-negatív sejteket megfelelő ellenfestékkel lehet láthatóvá tenni, ami általában a pozitív töltésű szafranin, ami rózsaszínre festi őket. A Gram-pozitív baktériumokon megtapadó rózsaszínt a kristályviola lila színe elfedi (ritka helyzetekben a szafranin helyett néha bázikus fuschint használnak).