Beyond the Michaelis-Menten equation: Accurate and efficient estimation of enzyme kinetic parameters

Two type of models describing enzyme kinetics: Az sQ és tQ modellek

Egy alapvető enzimreakció egyetlen enzimből és egyetlen szubsztrátból áll, ahol a szabad enzim (E) reverzibilisen kötődik a szubsztráthoz (S), hogy komplexet (C) képezzen, és a komplex irreverzibilisen disszociál a termékre (P) és a szabad enzimre:

ahol az enzim teljes koncentrációja (E T ≡ C + E) és a teljes szubsztrát- és termékkoncentráció (S T ≡ S + C + P) konzerválódik. A termék időbeli felhalmozódását leíró népszerű modell az MM egyenleten alapul, az alábbiak szerint (a részletes levezetést lásd a Kiegészítő módszerben):

hol K M = (k b + k cat )/k f a Michaelis-Menten állandó és k cat a katalitikus állandó. Ezt a standard QSSA-val levezetett sQ modellt széles körben használták a kinetikai paraméterek, K M és k cat becslésére a termék fejlődési görbéjéből8,9,10,11,11,23,25 . A termék felhalmozódását leíró másik modellt a teljes QSSA-val származtatják; ezt később fejlesztették ki, mint az sQ modellt, és ezért kevesebb figyelmet kapott a paraméterek becslésére26,27,28,29 :

Bár ez a tQ modell bonyolultabb, mint az sQ modell, szélesebb tartományokban pontosabb, mint az sQ modell. Különösen az sQ modell akkor pontos, ha

ami alacsony enzimkoncentrációt igényel7,14. Másrészt a tQ modell akkor pontos, ha

ahol K = k b /k f a disszociációs állandó27,28,29. Fontos, hogy ez a feltétel általánosan érvényes, és így a tQ modell az sQ modellel ellentétben akkor is pontos, ha az enzim feleslegben van. További részletekért lásd14,30.

Ezután megvizsgáltuk a mindkét modellel végzett sztochasztikus szimulációk pontosságát. Konkrétan összehasonlítottuk a Gillespie-algoritmus segítségével végzett sztochasztikus szimulációkat az eredeti teljes modell (S1. táblázatban leírt), az sQ modell (S2. táblázat) vagy a tQ modell (S3. táblázat) hajlamfüggvényei alapján 9 különböző állapotra31,32,33,34,35,36: E T vagy alacsonyabb, hasonló vagy magasabb, mint K M, és S T szintén vagy alacsonyabb, hasonló vagy magasabb, mint K M (1. ábra). Az sQ modell sztochasztikus szimulációi nem közelítik meg az eredeti teljes modell szimulációit, ha az E T nem alacsony (azaz az E T nem alacsonyabb, mint sem az S T, sem a K M ). Ezzel szemben a tQ modellt használó sztochasztikus szimulációk minden körülmények között pontosak (1. ábra), ami összhangban van egy nemrégiben készült vizsgálattal, amely szerint az sQ és a tQ modellekkel végzett sztochasztikus szimulációk pontosak, ha a determinisztikus érvényességi feltételek teljesülnek ((3. és 4. egyenlet)37,38 . Összességében a tQ modell a feltételek szélesebb tartományára érvényes, mint az sQ modell mind determinisztikus, mind sztochasztikus értelemben.

Míg az sQ modell az E T növekedésével nem közelíti az eredeti teljes modellt, a tQ modell az E T értéktől függetlenül pontos. Az eredeti teljes modell (S1. táblázat), az sQ modell (S2. táblázat) és a tQ modell (S3. táblázat) sztochasztikus szimulációit S T = 0,2, 2 vagy 80 nM és E T = 0,2, 2 vagy 40 nM mellett végeztük el. Megjegyzendő, hogy ezek a koncentrációk vagy alacsonyabbak, vagy hasonlóak, vagy magasabbak, mint a K M ≈ 2 nM. Itt a vonalak és a színes tartományok 104 sztochasztikus szimuláció átlagos pályáját és ingadozási tartományát (az átlagtól ±2σ) jelölik.

A tQ modellel végzett becslés torzításmentes az enzim- és szubsztrátkoncentrációk bármely kombinációjára

Mivel a tQ modell a körülmények szélesebb tartományára pontos, mint az sQ modell (1. ábra), feltételeztük, hogy a tQ modellen alapuló paraméterbecslés általánosabb körülményekre is pontos. E hipotézis vizsgálatához először 102 zajos P előrehaladási görbét generáltunk az eredeti teljes modell sztochasztikus szimulációiból (S1. ábra). Ezután ezekből a szimulált adatsorokból a paraméterekre (k cat és K M ) következtettünk a Bayes-féle következtetés alkalmazásával, az sQ vagy a tQ modellen alapuló valószínűségi függvényekkel, gyengén informatív gamma priorok mellett (S2. ábra) (a részleteket lásd a Módszereknél). Megjegyezzük, hogy ebben a tanulmányban végig a szimulált termékfejlődési görbéket használtuk (pl. S1. ábra), mivel az sQ-modellen és a tQ-modellen alapuló becslések pontos összehasonlításához ismernünk kell a paraméterek valódi értékeit.

Először a k kat becslésére összpontosítottunk, feltételezve, hogy a K M értéke ismert. Ha az E T alacsony, tehát mind az sQ, mind a tQ modell pontos (1. ábra balra), a két modellel kapott utólagos minták hasonlóak, és sikeresen megragadják a k cat valódi értékét (2a. ábra balra). A két modellel kapott utólagos minták hasonlóak, mert ha az E T alacsony, és így \({E}_{T}\ll {S}_{T}+{K}_{M}\), akkor a két modell (1. és 2. egyenlet) megközelítőleg egyenértékű az alábbiak szerint:

ahol az első közelítés a \({E}_{T}({S}_{T}-P)/({E}_{T}+{K}_{M}+{S}_{T}-P)\ll 1\) Taylor-féle kiterjesztésből származik. (a részleteket lásd27,28,29). Ezért, ha \({E}_{T}\ll {S}_{T}+{K}_{M}\) és így az sQ modell pontos, az sQ és a tQ modellekkel végzett becsléseknek hasonlónak kell lenniük. Másrészt, ha E T nagy, akkor egyértelmű különbséget mutatnak (2a. ábra jobbra): az sQ modellel kapott utólagos minták nagy hibát mutatnak, míg a tQ modellel kapott minták pontosan megragadják k cat valódi értékét .

Egyetlen paraméter (k cat vagy K M ) becslése az sQ vagy a tQ modellel. Minden feltételhez (S T = 0,2, 2 vagy 80 nM, és E T = 0,2, 2 vagy 40 nM) 105 utólagos mintát kaptunk a k cat (a) vagy a K M (b) paraméterre a Bayes-féle következtetés 102 zajos adatsorra való alkalmazásával (S1. ábra) (a részleteket lásd a Módszereknél). A k cat mintavételezésekor a K M a valódi értékénél van rögzítve (a) és fordítva (b). Itt a zöld háromszögek a paraméterek valódi értékeit jelölik. Míg az sQ modellel kapott k cat és K M becslések az E T növekedésével torzítottak, a tQ modellel kapott becslések a körülményektől függetlenül elhanyagolható torzítást mutatnak (a becslések dobozdiagramjait lásd az S3. ábrán). Az E T vagy az S T növekedésével a tQ modell használata esetén a K M poszterior szórása növekszik.

A poszterior átlagok és a poszterior variációs együtthatók (CV) boxplotjaiban is hasonló eredmények figyelhetők meg (S3a,b ábra). Míg az sQ modellel kapott poszterior átlagok torzítottak, ha az E T magas, a tQ modellel kapottak minden körülmények között pontosak (S3a. ábra). Különösen az utólagos átlagok keskeny eloszlása jelzi, hogy a k cat becslése a tQ modellel robusztus az adatokban lévő zajjal szemben (S1. ábra). Továbbá az utólagos CV-k sokkal kisebbek, mint az előzetes CV-k (S3b. ábra), ami a k cat pontos becslésére utal a tQ modellel.

A következő lépésben a K M becslését végeztük el azzal a feltételezéssel, hogy a k cat értéke ismert (2b. ábra). Az sQ modellel kapott K M utólagos mintái ismét az E T növekedésével növekvő hibákat mutatnak. Megjegyezzük, hogy a K M becslései felfelé torzítottak, ami azt jelenti, hogy a K M utólagos becsléseinek használata az MM egyenlet (\({K}_{M}\gg {E}_{T}\)) érvényesítésére félrevezető lehet. Másrészt a tQ modellel kapott K M becslések minden körülmények között kevéssé torzítottak. A k cat szűk utólagos eloszlásával ellentétben (2a. ábra) azonban a tQ modellel kapott K M eloszlások szélesebbé válnak; így a pontosság az E T vagy S T növekedésével csökken (2b. ábra). Ezek a minták a poszterior átlagok és a poszterior CV-k dobozdiagramjain is megfigyelhetők (S3c,d ábra). Az azonosíthatósági probléma azért merül fel, mert ha \({E}_{T}\gg {K}_{M}\) vagy \({S}_{T}\gg {K}_{M}\) és így \({E}_{T}+{S}_{T}\gg {K}_{M}\), a K M elhanyagolható a tQ modellben (Eq. 2), az alábbiak szerint:

Kifejezetten, ha K M túl alacsony, akkor K M értéke kevéssé befolyásolja a tQ modell dinamikáját, és így K M strukturálisan nem azonosítható. Összességében a K M becslése mind az sQ, mind a tQ modellel nem kielégítő, bár különböző okok miatt: az sQ modellel végzett becslések torzíthatnak, a tQ modellel végzettek pedig strukturálisan nem azonosíthatók (2b. ábra). Hasonló mintázatokat figyeltünk meg akkor is, amikor egy informatívabb prior adódott (S4. ábra). Különösen az sQ modellel kapott becslések még informatív prior mellett is jelentős hibát mutatnak az E T növekedésével.

A k cat és a K M egyidejű becslése az azonosíthatóság hiányától szenved

A következő lépésben két paraméter, a k cat és a K M egyidejű becslését vizsgáltuk, ami az enzimkinetika tipikus célja. Ugyanazoknál a gamma prioroknál, amelyeket az egyparaméteres becslésnél használtunk (2. ábra), a két modellel kapott poszterior minták eloszlása összességében szélesebb lett (3. ábra). Az ilyen pontatlan becslés okának megtalálása érdekében elemeztük a poszterior k cat és K M minták szórásdiagramjait (4. ábra). Amikor \({S}_{T}\ll {K}_{M}\) (ábra. 4a-c), az sQ modellel kapott k cat és K M utólagos mintái erős korrelációt mutattak, mivel az sQ modell dinamikája csak a k cat /K M aránytól függ, amint az a következő közelítésben látható:

ahol \\({K}_{M}\gg {S}_{T}\ge {S}_{T}-P\). Másrészt, ha \({S}_{T}\gg {K}_{M}\) (4g-i ábra), akkor az sQ modell szórásdiagramja vízszintessé válik, ami a K M szerkezet azonosíthatatlanságát jelzi. Valójában a K M értéke szinte semmilyen hatással nincs az sQ modell dinamikájára, amint az a következő közelítésben látható:

ahol K M + S T ≈ S T \({S}_{T}\gg {K}_{M}\). A paraméterek azonosításának ilyen mértékű hiánya, ha \({S}_{T}\ll {K}_{M}\) vagy \({S}_{T}\gg {K}_{M}\) esetén \({S}_{T}\gg {K}_{M}\), összhangban van a korábbi tanulmányokkal, amelyek S T ≈ K M használatát javasolják a pontosabb becsléshez22,23. A becslések azonban még S T ≈ K M esetén is pontatlanok (3a. és b. ábra középső). Továbbá az E T növekedésével az sQ modellel kapott becslések torzítottak (3. ábra), akárcsak az egyparaméteres becslésnél (2. ábra). Ezen elemzés alapján úgy tűnik, hogy a k cat és a K M egyidejű becslése az sQ modellel kihívást jelent mind az azonosíthatósági, mind a torzítási problémák miatt.

Két paraméter (k cat és K M ) egyidejű becslése az sQ vagy a tQ modellel. Ugyanabból a 102 adatsorból (S1. ábra), amelyet az egyparaméteres becsléshez (2. ábra) használtunk, a k cat (a) és a K M (b) 105 poszterior mintáját kaptuk meg együttesen. Bár ugyanaz a prior adott, a poszterior eloszlások szélesebbek lesznek, mint az egyparaméteres becslésnél (2. ábra). Itt a zöld háromszögek a k cat vagy a K M valódi értékeit jelölik .

A kétparaméteres becsléssel kapott poszterior minták szórásdiagramjai (3. ábra). A szórásdiagramok a struktúra azonosíthatatlanságának két típusát implikálják: a k cat és a K M közötti erős korrelációt, valamint a K M azonosíthatatlanságát, amelyet vízszintes diagramként ábrázolunk. A tQ modell pozitívan korrelált szórásdiagramjai vízszintesre változnak, ha a mintavételezett K M sokkal kisebb, mint S T + E T (szaggatott szürke vonalak). Itt a zöld háromszögek a paraméterek valódi értékeit jelölik.

Ha \({E}_{T}\gg {K}_{M}\) vagy \({S}_{T}\gg {K}_{M}\), a K M elhanyagolható hatással van a tQ modell dinamikájára (6. egyenlet), és így csak a k cat volt azonosítható az egyparaméteres becslésben (2a és b ábra jobbra vagy alul). Hasonlóképpen, amikor a tQ modellel egyszerre következtetünk mind a k cat-ra, mind a K M-re, csak a k cat becslése pontos és precíz (3a. és b ábra jobbra vagy alul), amint azt a k cat valódi értéke mentén a vízszintes szórásdiagramok is mutatják (4c,f,g-i ábra). Más esetekben (amikor sem \({E}_{T}\gg {K}_{M}\), sem \({S}_{T}\gg {K}_{M}\)) mindkét paraméter utólagos varianciája drámaian megnő az egyparaméteres becsléshez képest (2. és 3. ábra bal és felső). Az ilyen pontatlan becslés a szórásdiagramok szerint két forrásból ered (4a,b,d,e ábra). Amikor k cat és K M együttesen csökken, a tQ modell viselkedése alig változik, mint az SQ modellé (5. egyenlet), ami a k cat és K M utólagos mintái közötti erős korrelációhoz vezet. Ahogy a K M becslései folyamatosan csökkennek a k cat becsléseivel együtt, így azok sokkal kisebbek lesznek, mint az E T + S T (a 4. ábra szaggatott függőleges vonala), a tQ modell már nem függ a K M értékétől, ahogyan azt a 6. egyenlet mutatja, és így a szórásdiagramok vízszintessé válnak.

A különböző kísérletekből származó kombinált adatok pontos és precíz becslést tesznek lehetővé a tQ modellel

Amint fentebb látható, mind a k cat, mind a K M becslése egyetlen haladási görbe segítségével jelentős torzítástól és az azonosíthatóság hiányától szenved (3. és 4. ábra), ami összhangban van korábbi tanulmányokkal, amelyek arról számoltak be, hogy az egyetlen kísérletből nyert haladási görbe nem elegendő mindkét paraméter egyidejű azonosításához19. Ezért itt azt vizsgáljuk, hogy több, különböző kísérleti körülmények között kapott időfolyamat-adatsor felhasználásával javítható-e a becslés.

A tipikus in vitro vizsgálatokban a fejlődési görbéket vagy fix S T és változó E T, vagy fix E T és változó S T mellett mérik 8,9,10,11,39. Először azt az esetet vizsgáljuk meg, amikor a fejlődési görbéket fix S T és változó E T mellett mérjük. Pontosabban, az alacsony és a magas E T értékekből származó előrehaladási görbéket használjuk a paraméterek becsléséhez különböző szinteken rögzített S T esetén (S1. ábra fent és lent). Ebben az esetben az sQ modellel kapott utólagos minták jelentős hibákat mutatnak, mivel a magas E T-ről származó adatokat használják (5a. és S5. ábra). Másrészt a tQ modellel kapott utólagos minták pontosan és kis szórással rögzítik mind a k cat, mind a K M valódi értékeit (5a. és S5. ábra). Ez a javulás abból a tényből ered, hogy az alacsony és a magas E T alatt kapott adatok különböző típusú információkat szolgáltatnak a paraméterbecsléshez. Konkrétan, a magas E T adatokból, bár a K M nem azonosítható, a k cat pontosan becsülhető a tQ modellel (4c,f,i. ábra). A k cat ilyen pontos becslése a magas E T adatokból megakadályozhatja a k cat és a K M közötti korrelációt, amikor azokat az alacsony E T adatokból becsüljük (4a,d. ábra). A tQ modell keskeny szórásdiagramjai (5b. ábra balra és középen) valójában két szórásdiagram metszéspontja, a magas E T adatokkal kapott vízszintes (4c,f ábra) és az alacsony E T adatokkal kapott nem vízszintes (4a,d ábra). Ha azonban az S T magas, az alacsony E T értékekből származó szórásdiagram is vízszintessé válik (4c. ábra), és így a kombinált adatok használatának szinergikus hatása csökken (5a. ábra, b. jobbra). Összességében a tQ modell mindkét paramétert pontosan meg tudja becsülni az alacsony E T és a magas E T adatok kombinációjából, ha az S T nem sokkal nagyobb, mint K M . Megjegyzendő, hogy az ilyen alacsony S T előnyben részesül az in vitro kísérleteknél24,39,40,41 és ez a helyzet a legtöbb fiziológiai körülmények között24.

Ha alacsony E T és magas E T mellett kapott adatokat együttesen használjuk, a tQ modellel, de nem az sQ modellel kapott becslések pontossága és precizitása javul. (a) Az E T = 0,2 nM (S1 felső ábra) és E T = 40 nM (S1 alsó ábra) adathalmazok együttes felhasználásával levezetett utólagos minták S T = 0,2, 2 vagy 80 nM esetén. A tQ modell utólagos varianciája drámaian csökken az egyparaméteres becslés szintjére (2. ábra). Az sQ modell becslései azonban jelentős torzítást mutatnak. Itt a zöld háromszögek a k cat vagy a K M valódi értékeit jelölik. (b) Az utólagos minták szórásdiagramjai. Itt a zöld háromszögek, a kék körök és a piros négyzetek a valódi értékeket, az sQ modell poszterior középértékeit, illetve a tQ modell értékeit jelölik.

A következőkben azt az esetet vizsgáljuk, amikor a haladási görbéket fix E T és változó S T mellett mérjük. Pontosabban, az alacsony és a magas S T értékekből származó két haladásgörbe kombinációját használjuk arra, hogy különböző szinteken rögzített E T esetén paraméterekre következtessünk (S1. ábra balra és jobbra). Ha az E T alacsony, és így az sQ és a tQ modellek hasonlóan viselkednek (5. egyenlet), a mindkét modellel kapott utólagos minták pontosan rögzítik a k cat és a K M valódi értékeit (6a. ábra balra és S6). A keskeny szórásdiagramot (6b. ábra balra) ismét az alacsony S T (4a. ábra) és a magas S T (4g. ábra) nem vízszintes szórásdiagramjának metszéspontjaként kapjuk. Azonban ahogy az E T növekszik, és így az sQ modell egyre pontatlanabbá válik, az sQ modellel kapott értékek a várakozásoknak megfelelően torzítottak (6a. ábra jobbra és S6). Míg a tQ modellel kapott becsléseknél ilyen torzítások nem figyelhetők meg, a K M becslések pontossága az E T növekedésével csökken, akárcsak az egyparaméteres becslésnél (2. ábra és 6. egyenlet).

becslés az alacsony S T és magas S T mellett kapott adatok együttes felhasználásával. (a) Az utólagos minták következtetése S T = 0,2 nM (S1. ábra bal oldali) és S T = 80 nM (S1. ábra jobb oldali) adatsorok felhasználásával együttesen E T = 0,2, 2 vagy 40 nM esetén. Ha az E T alacsony, mind az sQ, mind a tQ modellek pontos és precíz becslést tesznek lehetővé. Az E T növekedésével az sQ modellel kapott becslések pontatlanná válnak, és a tQ modellel kapott K M becslések pontatlanabbá válnak, hasonlóan az egyparaméteres becsléshez (2. ábra). Itt a zöld háromszögek a k cat vagy a K M valódi értékeit jelölik. (b) Az utólagos minták szórásdiagramjai. Itt a zöld háromszögek, a kék körök és a piros négyzetek az igaz értékeket, az sQ modell poszterior középértékeit, illetve a tQ modell értékeit jelölik.

Kísérletek optimális tervezése a pontos és hatékony becsléshez a tQ modellel

Ha egyetlen kísérletből kapott haladási görbét használunk, a tQ modell poszterior szórásdiagramjai korrelált típusba (4a,b,d,e ábra) és horizontális típusba (4c,f,g-i ábra) sorolhatók. E két különböző típusú szórásdiagram metszéspontjai általában szűk eloszlásúak a valódi érték közelében (5b. és 6b. ábra). Így a két ilyen adatsor kombinálása lehetővé teszi mind a k cat, mind a K M pontos becslését (5a. és 6a. ábra). Konkrétan, egy \({E}_{T}\ll {K}_{M}\) és \({S}_{T}\ll {K}_{M}\) alatt mért progressziós görbe (4a,b,d,e ábra) és egy \({E}_{T}\gg {K}_{M}\) vagy \({S}_{T}\gg {K}_{M}\) alatt mért görbe (4a,b,d,e ábra) és egy \({S}_{T}\gg {K}_{M}\) alatt mért görbe (4a,b,e ábra). 4c,f,g-i) különböző típusú információkat szolgáltatnak a paraméterbecsléshez; így mindkét adatsor felhasználása sikeres becsléshez vezet. A gyakorlatban azonban nehéz összehasonlítani az S T , az E T és a K M értékeit, mivel a K M értéke általában a priori ismeretlen. Ez a probléma könnyen megoldható a szórásdiagram használatával. Azaz, ha az első kísérletből kapott utólagos szórásdiagram vízszintes, akkor a következő kísérlethez mind az E T-t, mind az S T-t csökkenteni kell, így nem vízszintes szórásdiagramot kapunk (7a. ábra). Másrészt, ha az első kísérletből származó szórásdiagram erős korrelációt mutat a K M és a k cat között, akkor a következő kísérletben vagy az S T-t, vagy az E T-t kell növelni (7b. ábra). Alapvetően a K M és k cat értékére vonatkozó előzetes információ nélkül a jelenlegi becslések szórásdiagramjainak alakja határozza meg a következő optimális kísérleti tervet, ami biztosítja a pontos és precíz becslést. Ez a megközelítés azonban nem alkalmazható az sQ modellel, mivel az sQ modellel végzett becslés torz lehet az E T vagy S T és K M közötti kapcsolat függvényében, amely a priori ismeretlen. Vagyis a tQ modellel ellentétben a pontos becslés nem mindig garantálja a pontos becslést az sQ modellel, amint azt a fentiekben láttuk (pl. 5a. ábra jobbra).

A tQ modellel végzett pontos és precíz becslés optimális kísérleti terve. (a) Ha az első kísérletből származó utólagos minták szórásdiagramja vízszintes, az E T és S T értékeket csökkenteni kell, hogy a következő kísérletben nem vízszintes szórásdiagramot kapjunk. Ezután a két kísérlet kombinációjának használata pontos és precíz becsléshez vezet (piros szórásdiagramok). (b) Ha az első kísérlet szórásdiagramja nem vízszintes, akkor a következő kísérletben növelni kell az E T-t vagy az S T-t, hogy vízszintes szórásdiagramot kapjunk. (c) Az alacsony E T (0,1 K M ) és a magas E T (10 K M ) egyetlen haladási görbével történő következtetés nem vízszintes, illetve vízszintes szórásdiagramokhoz vezet a kimotripszin, az ureáz és a fumaráz esetében (szürke szórásdiagramok). Amikor mindkét adatsort együttesen használtuk, pontos becsléseket kaptunk minden enzimre (piros szórásdiagramok). Itt alacsony S T (0,1 K M ) értéket használtunk. Itt a zöld háromszögek a paraméterek valódi értékeit jelölik.

Teszteljük, hogy a javasolt megközelítés a tQ modellel pontosan meg tudja-e becsülni a k cat és a K M értékeket az N-acetil-glicin-etilészter, a fumarát és a karbamid katalízisére a kimotripszin, az ureáz és a fumaráz enzimek által (7c. ábra). Ezt a három enzimet azért választottuk, mert eltérő katalitikus hatásfokkal rendelkeznek (k cat /K M )1: 0,12, 4 – 105, illetve 1,6 – 108 s -1 M -1 . Mindegyik enzim esetében 102 zajos időfolyamat-adatsort hoztunk létre sztochasztikus szimulációkkal az ismert enzimkinetikai paraméterek1 alapján. Ha az alacsony E T és alacsony S T mellett kapott haladási görbéket használjuk, a várakozásoknak megfelelően mindhárom enzim esetében nem vízszintes szórásdiagramokat kaptunk az utólagos mintákból (7c. ábra). Ez azt jelzi, hogy a következő kísérletben vagy az E T-t vagy az S T-t növelni kell ahhoz, hogy vízszintes szórásdiagramot kapjunk. Valóban, amikor az E T 100-szoros növelését tartalmazó progresszív görbét használtuk, vízszintes szórásdiagramokat kaptunk minden enzim esetében (7c. ábra). Ezért, ha ezt a két fejlődési görbét együtt használjuk, mind a k cat, mind a K M pontosan becsülhető (7c. ábra piros pontok). Ezek az eredmények alátámasztják, hogy az ilyen kétlépéses optimalizált kísérleti tervezés (7a. és 7b. ábra), amely két különböző típusú szórásdiagramot eredményez, lehetővé teszi az enzimkinetika pontos és hatékony becslését a tQ modellel. Az ilyen becslést végző számítási csomagot megadtuk (a részleteket lásd a Módszer című fejezetben).