John Wilkes Booth kiugrik a Ford Színház elnöki páholyából, miután lelőtte Lincolnt és leszúrta Rathbone őrnagyot.
1865. április 11-én, két nappal azután, hogy Lee Appomattoxban megadta magát, Lincoln beszédet mondott, amelyben felvázolta a béke és az újjáépítés terveit. A közönség soraiban ott volt John Wilkes Booth, egy sikeres színész, aki Marylandben született és nőtt fel. Booth a rabszolgaság és a fehér felsőbbrendűség lelkes híve volt. Lincoln szavait hallva így szólt egyik társához: “Most, Istenemre mondom, elintézem. Ez volt az utolsó beszéde, amit valaha is elmondott.”
Miután az év elején két kísérlet is kudarcot vallott az elnök elrablására, Booth úgy döntött, hogy Lincolnt meg kell ölni. Összeesküvése nagyszabású volt. Booth és társai úgy döntöttek, hogy ugyanazon az estén meggyilkolják az elnököt, Andrew Johnson alelnököt és William Seward külügyminisztert. Lincoln úgy döntött, hogy megnézi a Ford’s Theaterben az Our American Cousin című brit vígjátékot, amelynek főszereplője a híres színésznő, Laura Keene volt. Ulysses S. Grant úgy tervezte, hogy elkíséri az elnököt és feleségét, de napközben úgy döntött, hogy meglátogatja fiát New Jerseyben. Aznap este Lincolnékkal együtt részt vett a színdarabon Henry Rathbone őrnagy és menyasszonya, Clara Harris, egy prominens szenátor lánya.
Ez a szélessávú lap Lincoln elnök és Seward külügyminiszter meggyilkolását jelenti be. Valójában Seward túlélte a támadást.
Aznap este a színdarab közepén Booth besurrant az elnöki páholy bejáratán, bal kezében egy tőrt, jobbjában egy Derringer pisztolyt tartott. A pisztollyal hat hüvelyknyire lőtt Lincolntól, a késsel pedig Rathbone karját vágta el. Booth ezután átugrott az elnöki páholy elejére, jobb lábát egy zászlóba kapta, és a színpadon landolt, eltörve a lábát. Meglengette a tőrét, és azt kiáltotta, ami a beszámolók szerint Sic semper tyrannis – latinul “így legyen mindig a zsarnokoknak”. Egyes beszámolók szerint azt mondta: “A Dél megbosszulja magát”. Ezután sántikálva kirohant a színházból, felpattant a lovára, és Virginia felé lovagolt.
A golyó Lincoln fejébe fúródott, közvetlenül a bal füle mögött, átszakította az agyát, és közvetlenül a jobb szeme mögött fúródott be. A sérülés halálos volt. Lincolnt egy közeli panzióba szállították, ahol másnap reggel meghalt. A többi célpont megúszta a halált. Lewis Powell, Booth egyik bűntársa Seward házához ment, leszúrta és súlyosan megsebesítette az államtitkárt, de Seward túlélte. Egy másik bűntársa, George Atzerodt nem tudta rávenni magát, hogy megpróbálja meggyilkolni Johnson alelnököt.
Két héttel később, április 26-án az uniós lovasság csapdába ejtette Booth-t egy virginiai dohánypajtában. A katonáknak parancsuk volt, hogy ne lőjenek, és úgy döntöttek, hogy felgyújtják a pajtából. Tüzet gyújtottak. Mielőtt Booth még reagálhatott volna, Boston Corbett őrmester célba vette és halálosan lelőtte Booth-t. A haldokló merénylőt egy tornácra hurcolták, ahol utolsó szavai így hangzottak el: “Haszontalan … haszontalan!”
Az elnök meggyilkolásának összeesküvőit a Hunter-bizottság néven ismert katonai törvényszék előtt állították bíróság elé.
A vonat kerülő úton hazaszállította Lincoln holttestét, hogy az Illinois állambeli Springfieldben temessék el. A gyászoló nép százezrével jelent meg, hogy búcsút vegyen elnökétől, aki elsőként esett el egy merénylő golyója által.