TOIMINTA
Ibuprofeeni kuuluu ei-steroidisten tulehduskipulääkkeiden (NSAID) ryhmään, jota käytetään erilaisten tulehdusprosessien, kivun tai kuumeen hoitoon. Ibuprofeenin vaikutusten taustalla oleva mekanismi juontaa juurensa syklo-oksygenaasin (COX) aktiivisuuden estämisestä, jota tarvitaan prostaglandiinien (PG) synteesiin.1 PG:tä tuotetaan plasmakalvosta peräisin olevasta arakidonihaposta, ja paikallisella PG:n tuotannolla on hormonien kaltaisia vaikutuksia. Ihmiskudoksissa ilmentyy kaksi COX-isoformia: konstitutiivisesti ilmentyvä COX-1-isoformi esiintyy useimmissa kudoksissa, kun taas COX-2-isoformi indusoituu voimakkaasti tulehdusreaktion aikana, mukaan lukien kroonisen tulehduksen ja paksusuolen syövän patologiset tilat.2 COX-2-valmisteista korkeimmat PGE2-pitoisuudet esiintyvät kasvaimissa, ja ne vaikuttavat erilaisiin prosesseihin, kuten solujen proliferaatioon ja apoptoosiin.3 Normaalissa fysiologiassa PGE2:lla on merkitystä ruoansulatuskanavan limakalvojen ylläpidossa, sillä se säätelee prosesseja, kuten liman eritystä ja verisuonten laajenemista.4 Pitkäaikainen tulehduskipulääkehoito voi siis johtaa haittavaikutuksiin, muun muassa verenvuotoon suolistosta. Useimmat tulehduskipulääkkeet, mukaan lukien ibuprofeeni, estävät molempia COX-isoformeja.
Profylaktisen tulehduskipulääkkeiden käytön on dokumentoitu vähentävän riskiä kuolla paksusuolen ja peräsuolen syöpään.5-9 Esimerkiksi 300 mg:n päivittäinen aspiriiniannos 10 vuoden ajan osoitti tilastollisesti merkitsevää suojavaikutusta.7,10,11 Vastaavanlainen riskin pieneneminen raportoitiin 200 mg:n päivittäisellä ibuprofeenin annoksella,8,11,11-19 erilaisten kasvaintyyppien osalta: 19
MITEN IBUPROFEN ENNALTAEHKÄISEE SYÖPÄÄ?
Kerääntyvä näyttö on osoittanut, että tulehdus edistää kasvainten syntyä20,21 erityisesti silloin, kun kudos on kroonisissa tulehdusolosuhteissa. Kasvaimen mikroympäristössä tulehdussolut vaihtavat signaaleja kasvainsolujen kanssa. Stroomaaliset solut erittävät kasvainsolujen selviytymistekijöitä, kun taas kasvainsolut tuottavat sytokiineja, jotka käynnistävät stroomaalisten solujen suorittaman solunulkoisen matriksin proteolyyttisen uudelleenmuotoilun tai uusien verisuonten muodostumisen.20,22 Ibuprofeeni estää COX:n aktiivisuutta ja sitä seuraavaa proinflammatorisen PG:n muodostumista; tämän vaikutuksen uskotaan olevan ibuprofeenin solunsalpaajalääkkeiden kemopreventiivisen vaikutuksen taustalla. PGE2 esimerkiksi aktivoi G-proteiinikytkentäisiä PGE2-reseptoreita, jotka stimuloivat erilaisia solujen proliferaatioon ja eloonjäämiseen osallistuvia signalointireittejä.23,24
Tässä artikkelissa kirjoittajat tarkastelevat COX-2:n estosta riippumattomia lisävaikutusmekanismeja tavoitteenaan lisätä tietoisuutta siitä, että ibuprofeenin kliiniset vaikutukset voivat olla useiden soluprosessien välittämiä. Esitetty näyttö haettiin PubMed-hakukoneesta käyttäen hakusanaa ”ibuprofen AND cancer”. Katsaukseen valittiin tutkimukset, joissa raportoitiin COX:stä riippumattomista vaikutuksista, mukaan lukien kirjoittajien laboratoriossa tehdyt tutkimukset.
LISÄMEKANISMIT, JOIDEN KAUTTA IBUPROFEN INHIBOITTAA KASVAINSOLUJA
Vuonna 2015 Matos ja Jordan25 tarkastelivat syöpäsolujen hoitoa ibuprofeenilla. HCT-116-paksusuolisolut eivät ilmentäneet COX-2:ta, mutta käsittely 2 mMol/l ibuprofeenilla tuotti proapoptoottisia vaikutuksia.26 Ibuprofeeni matalana pitoisuutena 100 µMol tunnistettiin lisäksi peroksisomeja aktivoivan proliferaattorireseptori gamman (PPARγ) suoraksi ja COX:stä riippumattomaksi ligandiksi27 , ja sen osoitettiin stimuloivan sen ydinaktiivisuutta paksusuolen syövän muodostumisen rottaisissa malleissa.28 Näin ollen ibuprofeenin havaittu proapoptoottinen vaikutus voi osittain johtua PPARγ:n aktivaatiosta, joka johtaa antiapoptoottisen transkriptiotekijän NFκB:n alaregulaatioon.28
Toisen COX:stä riippumattoman soluvasteen ibuprofeenikäsittelyn jälkeen raportoitiin liittyvän P75NTR:ään, joka kuuluu TNF-reseptorin superperheeseen. Syöpäsolujen käsittely 1 mMol/l ibuprofeenilla johti p38 mitogeeni-aktivoidun proteiinikinaasin reitistä riippuvaiseen p75NTR:n mRNA:n stabiilisoitumiseen, mikä johti lisääntyneisiin ekspressiotasoihin29 ja apoptoosin induktioon ja kasvun estoon.30
Yhtäläinen apoptoosia edistävä vaikutus raportoitiin HCT116-soluissa, kun ibuprofeenikäsittelyn (1,5 mM:aa 24 tunnin ajan) havaittiin herkistävän nämä solut TNF:ään liittyvää apoptoosia indusoivaa ligandia vastaan.31 Taustalla oleva mekanismi liittyi TNF:ään liittyvän apoptoosia indusoivan ligandin kalvoreseptorin ilmentymiseen: kuolemareseptori 5, joka on toinen TNF-reseptorien superperheen jäsen.
Ibuprofeenikäsittelyn (1 mMol/l 24 tunnin ajan) raportoitiin lisäksi vähentävän merkittävästi β-kateniinin ydintasoja SW480- ja DLD-1-kolorektaalikasvainsoluissa. Vastaavasti yhden sen transkriptionaalisen kohteen, proproliferatiivisen sykliini D1 -geenin, ilmentyminen tukahdutettiin.32 Vaikka taustalla oleva mekanismi on vielä selvittämättä, tämä ibuprofeenin vaikutus vaikuttaa erityisen kiinnostavalta paksusuolen syövän ennaltaehkäisyn kannalta, koska liiallinen β-kateniinisignaalin välittäminen voi aiheuttaa paksusuolen limakalvon kantasolujen epätarkoituksenmukaista kasvustimulaatiota.33
Vaikutuksen β-kateniinisignaalin välittämisen lisäksi ibuprofeenilla oli myös suoraa vaikutusta NF-β- eli NF-β-rataan. Soluissa havaittu ibuprofeenikäsittelyn nopea vaikutus on GSK-3β:n estävä fosforylaatio seriinissä 9.32 Tämän modifikaation havaittiin säätelevän negatiivisesti NFκB-signalointia sen inhibiittoriproteiini IkBα:n hajoamisen jälkeisessä vaiheessa ja tukahduttavan anti-apoptoottisten NFκB:n kohdegeenien, kuten BCL2:n ja BIRC5:n, ilmentymistä.
Muita esimerkkejä 100 µMol ibuprofeenin COX:stä riippumattomista vaikutuksista ovat integriini-ekspression estäminen neutrofiileissä34 tai proinflammatoristen sytokiinien kaspaasivälitteinen vapautuminen HCT-116- ja HeLa-soluissa35.
IBUPROFENI, ALTERNATIIVINEN SPLIKOITUMINEN JA SYÖPÄ
Syöpäsolut eroavat geeniekspressio-ohjelmaltaan vastaavista erilaistuneista normaaleista soluista. Geenipromoottoreissa tapahtuvan transkriptionaalisen säätelyn lisäksi viimeiset 15 vuotta ovat selvästi osoittaneet, että vaihtoehtoinen pilkkoutuminen toimii merkittävänä mekanismina geeniekspression säätelyssä. Vaihtoehtoinen splikointi tuottaa esimerkiksi transkriptiovariantteja, jotka voivat olla joko toimimattomia ja nopeasti hajoavia tai jotka voidaan kääntää proteiini-isomuodoiksi, joilla on erilaiset, joskus jopa antagonistiset toiminnalliset ominaisuudet toiminnallisten proteiinidomeenien erilaisen käytön vuoksi36,37 .
Uudemmin ibuprofeenin toisena COX-riippumattomana vaikutuksena tunnistettiin RAC1b:n vaihtoehtoisen splikointivariantin inhibitio.38 Paksusuolen tulehdus osoitettiin yhdeksi laukaisevaksi tekijäksi, joka lisää kasvaimiin liittyvän RAC1b-proteiinin, pienen GTPaasi RAC1:n splikointivariantin, ilmentymistä. RAC1b-proteiini sisältää ylimääräisen domeenin, jota koodataan 57 emäsparin pituisella vaihtoehtoisella eksonilla (eksoni 3b), joka lisää proteiinin aktivoitumista ja tuottaa hyperaktiivisen muunnoksen, joka pystyy stimuloimaan NFκB-signalointia.39-42. Kun paksusuolisoluja käsiteltiin ibuprofeenilla mutta ei aspiriinilla tai flurbiprofeenilla, sekä RAC1b:n mRNA- että proteiinitasot pienenivät selvästi in vitro ja in vivo.38 Monissa tutkimuksissa, jotka koskivat tulehduskipulääkkeiden vaikutusta kasvainsolujen elinkelpoisuuteen, käytettiin pitoisuuksia, jotka olivat jopa 2 mMol/l,43 ibuprofeenin vaikutus RAC1b:n vaihtoehtoiseen pilkkoutumiseen havaittiin matalilla annoksilla, jotka olivat suuruusluokassaan 100 µMol. Mielenkiintoista oli, että ibuprofeeni esti RAC1b-positiivisia HT29-paksusuolisoluja enemmän kuin normaaleja paksusuolisoluja ja vaikutti myös niiden kasvuun ihonalaisina kasvainksenografteina hiirissä. Ibuprofeenin inhiboiva vaikutus voitiin pelastaa, kun HT29-solussa ilmentyi spleikkauksesta riippumaton RAC1b-cDNA-sekvenssi38. Tämä viittaa siihen, että ibuprofeeni vaikuttaa suoraan vaihtoehtoiseen pilkkoutumistapahtumaan.
Toinen raportti vaihtoehtoisen pilkkoutumisen modulaatiosta saatiin, kun eturauhassyöpäsolut saivat yhdistelmähoitoa ibuprofeenilla ja epigallokatekiini-3-gallaatilla (EGCG), vihreän teen ainesosalla, jolla on antikarsinogeenisia ominaisuuksia ja joka edistää solusyklin pysähtymistä ja apoptoosia. Tällöin BCL-X:n ja MCL-1:n anti ja proapoptoottisten splikointivarianttien välinen tasapaino siirtyi kohti lyhyempiä ja proapoptoottisia BCL-X(S)- tai MCL-1(S)-variantteja.44. Vaikka mekanismia ei täysin tunnistettu, siihen liittyy proteiinifosfataasi PP1:n aktivoituminen, jonka tiedetään defosforyloivan pre-mRNA:n splikointiin osallistuvia säätelyproteiineja.
MEKANISMI, JOKA IBUPROFENILLA MODULOIDAAN SPLIKOINTIA
Kun proteiineja koodaavia geenejä ekspressoidaan ihmissoluissa, RNA-polymeraasi 2 tuottaa primaarisen transkriptin, pre-mRNA:n, jossa on koodaavia eksoneja, jotka on erotettu toisistaan intronisilla sekvensseillä. Kun transkriptio on käynnissä, jokaisen eksonin ja intronin yhtymäkohdan ympärillä olevat konservoidut nukleotidisekvenssit tunnistetaan spliceosomissa, joka on makromolekulaarinen koneisto, johon kuuluu viisi pientä ydinribonukleoproteiinipartikkelia (U1-, U2-, U4-, U5- ja U6-pienet ydinribonukleoproteiinit),45,46 ja joka sen jälkeen poistaa intronit mRNA:n spliceerausprosessin aikana. Spliceosomin toimintaa avustavat splice enhancer- tai silencer-elementit, jotka ovat eksoneissa tai introneissa esiintyviä lyhyitä sekvenssejä, jotka joko edistävät tai estävät spliceosomin tuottavaa tunnistamista tietystä eksonista. Splikointitekijät tunnistavat nämä splikointitekijät, jotka useimmiten kuuluvat seriini- ja arginiinirikkaiden proteiinien perheeseen tai heterogeenisiin ydinribonukleoproteiineihin. Ne toimivat usein antagonistisesti, joten sitoutumisen modulointi tarjoaa mekanismin, joka mahdollistaa vaihtoehtoisen eksonin sisällyttämisen tai ohittamisen ja siten varianttien transkriptien syntymisen. Kaiken kaikkiaan tietyssä solussa ilmentyvien spleikkaustekijöiden joukko ja niiden suhteelliset ilmentymistasot solun ytimessä toimivat kombinatorisesti vaihtoehtoisen spleikkauksen säätelemiseksi.
RAC1b:n tapauksessa vaihtoehtoista splikointia säätelevät eksonissa 3b oleva tehostuselementti, jonka tunnistaa splikointitekijä SRSF1, ja viereinen silencer-elementti, jonka tunnistaa SRSF3.47
Henkilön paksusuolisoluissa SRSF1:n saatavuus ytimessä on tärkein tekijä, joka säätelee eksoni 3b:n sisällyttämistä tai ohittamista.48
Yksi mekanismi, jonka kautta ibuprofeeni vaikuttaa vaihtoehtoiseen splikointiin soluissa, on SRSF1:n fosforylaatiotilanne. Solujen fraktiointi- ja immunoblot-kokeet osoittivat, että ibuprofeenikäsittely aiheutti SRSF1:n fosforylaation vähenemisen (julkaisemattomat tiedot). Sitä vastoin aspiriinihoidolla ei ollut tällaista vaikutusta SRSF1:een. Tämä osoitti, että ibuprofeenin estävä vaikutus RAC1b:n pilkkomiseen liittyi SRSF1:n subcellulaarisen lokalisoitumisen posttranslationaaliseen säätelyyn.48
Pääasiallinen SRSF1:n fosforylaatiosta vastaava proteiinikinaasi on SRPK1, jota esiintyy sekä sytoplasmassa että solun ytimessä.49,50 Tätä prosessia ohjaa osittain kasvutekijäreseptorin signalointi.51 Kuten kuvassa 1 on esitetty ja kuvattu, kirjoittajat havaitsivat, että ibuprofeenihoito indusoi SRPK1:n translokaation ytimestä sytoplasmaan, ja tämä korreloi SRSF1:n fosforylaation ja RAC1b-proteiinin vähentyneiden tasojen kanssa, jotka havaittiin kokosolujen lyseaatissa western blotilla. Tällaista vaikutusta ei havaittu, kun soluja käsiteltiin aspiriinilla samoissa olosuhteissa, mikä korostaa ibuprofeenin COX:stä riippumatonta vaikutusta ja sen vaikutuksen spesifisyyttä liitostekijöiden modulaatioon.