Tavoitteet:

1. Erottaa toisistaan kaksi suurta bakteeriryhmää: Grampositiiviset ja gramnegatiiviset.
2. Ymmärtää, miten gramvärjäysreaktio vaikuttaa grampositiivisiin ja gramnegatiivisiin bakteereihin niiden soluseinien biokemiallisten ja rakenteellisten erojen perusteella.

Klikkaa nähdäksesi animaation

Värjäys on mikroskooppisissa tekniikoissa käytetty apuväline, jolla pyritään lisäämään mikroskooppisen kuvan selkeyttä.Värjäyksiä ja väriaineita käytetään laajalti tieteenalalla korostamaan biologisten näytteiden, solujen, kudosten jne. rakennetta.

Mikrobiologiassa käytetyin värjäysmenetelmä on Gram-värjäys, jonka tanskalainen tiedemies ja lääkäri Hans Christian Joachim Gram keksi vuonna 1884. Gram-värjäys on erivärjäystekniikka, jolla bakteerit erotetaan kahteen ryhmään: grampositiivisiin ja gramnegatiivisiin. Menetelmä perustuu mikro-organismien kykyyn säilyttää gramvärjäysreaktiossa käytettyjen väriaineiden väri. Gramnegatiiviset bakteerit hajoavat alkoholin vaikutuksesta, jolloin ne menettävät ensisijaisen väriaineen värin, violetin, värin. Alkoholi ei hajota grampositiivisia bakteereja ja ne pysyvät violetteina. Värinpoistovaiheen jälkeen käytetään vastavärjäystä, joka antaa vaaleanpunaisen värin värjäytyneille gramnegatiivisille organismeille.

Kuva: Hans Christian Joachim Gram

Gram-värjäyksen merkitys:

Gram-värjäys on erittäin tärkeä alustava vaihe bakteerien alustavassa luonnehdinnassa ja luokittelussa. Se on myös keskeinen menettely bakteerien tunnistamisessa värjäysominaisuuksien perusteella, jolloin bakteereita voidaan tutkia valomikroskoopilla. Värjäämättömässä preparaatissa olevat bakteerit ovat näkymättömiä, kun niitä tarkastellaan valomikroskoopilla. Kun bakteerit on värjätty, niiden morfologia ja asettelu voidaan myös havaita. Lisäksi se on tärkeä vaihe tartunnanaiheuttajien seulonnassa kliinisissä näytteissä, kuten suorissa potilasnäytteissä.

Gram-värjäysmenetelmä mahdollistaa sen, että bakteerit säilyttävät väriaineiden värin, joka perustuu soluseinän kemiallisten ja fysikaalisten ominaisuuksien eroavaisuuksiin.

1. Gram-värjäysmenetelmän avulla bakteerit säilyttävät väriaineensa. Grampositiiviset bakteerit: Värjäytyvät tumman purppuranpunaisiksi, koska soluseinämässä säilyy primaariväriaine nimeltä Crystal Violet.

Esimerkki: Kuva: Grampositiiviset bakteerit

Kuva: Grampositiiviset bakteerit

2. Grampositiiviset bakteerit. Gramnegatiiviset bakteerit: Värjäytyvät punaisiksi tai vaaleanpunaisiksi Safranin-nimisen vastavärjäysväriaineen pidättämisen vuoksi.

Esim: Escherichia coli

Kuva: Gramnegatiiviset bakteerit

Bakteerimorfologia:

Bakteerit ovat hyvin pieniä yksisoluisia mikro-organismeja, jotka ovat kaikkialla luonnossa. Ne ovat kooltaan mikrometrejä (1µm = 10-6 m). Niiden soluseinät koostuvat peptidoglykaanista, ja ne lisääntyvät kaksoissidoksella. Bakteerien morfologiset ominaisuudet vaihtelevat.

Yleisimmät morfologiat ovat:

Coccus (pleura: Cocci):

Pallomaisia bakteereja; voivat esiintyä pareittain (diplokokit), neljän yksilön ryhmissä (tetrakokit), viinirypäleiden kaltaisina rykelminä (stafylokokit), ketjuina (streptokokit) tai kuutiomaisina järjestelyinä, joissa on kahdeksan yksilön määrä tai useampia yksilöitä (sarkokit).

Esim: Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes

Bacillus (pleural: Bacilli):

Sauvamaiset bakteerit; esiintyvät yleensä yksittäin, mutta voivat joskus esiintyä pareittain (diplo-bacillit) tai ketjuina (streptobacillit).

Esim: Bacillus cereus, Clostridium tetani

Spirillum (pleura: Spirilla):

Spiraalinmuotoiset bakteerit

Esim: Spirillum, Vibrio, Spirochete-lajit.

Joillakin bakteereilla on muitakin muotoja, kuten:

Coccobacilli: Pitkänomainen pallomainen tai soikea olomuoto.

Filamenttimaiset: Bakteerit, jotka esiintyvät pitkinä ketjuina tai säikeinä.

Fusiform: Bacillit, joilla on kapenevat päät.

Kuva: Erilaiset bakteerimorfologiat

Gram-värjäysmekanismi:

Gram-positiivinen soluseinä:

Gram-positiivisilla bakteereilla on paksu verkkomainen soluseinämä, joka koostuu peptidoglykaanista (50-90 % soluseinästä), joka värjäytyy violetiksi. Peptidoglykaani on pääasiassa polysakkaridi, joka koostuu kahdesta alayksiköstä eli N-asetyyliglukosamiinista ja N-asetyylimuramiinihaposta. Kun vierekkäiset peptidoglykaanikerrokset muodostuvat, ne yhdistyvät transpeptidaasientsyymin avulla lyhyillä peptidiketjuilla, jolloin soluseinän muoto ja jäykkyys syntyvät. Grampositiivisten organismien paksu peptidoglykaanikerros mahdollistaa sen, että nämä organismit pystyvät säilyttämään kristallivioletti-jodi-kompleksin ja värjäävät solut violetiksi.

Lipotekaanihappo (LTA) on toinen grampositiivisten bakteerien soluseinän tärkeä ainesosa, joka on upotettu peptidoglykaanikerrokseen. Se koostuu teichoehapoista, jotka ovat pitkiä ribitolifosfaattiketjuja, jotka on ankkuroitu lipidikaksoiskerrokseen glyseridin välityksellä. Se toimii autolyyttisten seinämäentsyymien (muramidaasit: Soluseinässä sijaitsevat bakteerientsyymit, jotka aiheuttavat solun hajoamisen vamman tai kuoleman jälkeen)

Gram-positiivisen soluseinän lääketieteellinen merkitys:

LTA:lla on myös antigeenisiä ominaisuuksia, jotka kiihdyttävät spesifisiä immuunivasteiden syntymistä, kun se irtoaa solun seinämästä solun kuoleman jälkeen. Solukuolema johtuu postnly lysosyymitoiminnan, leukosyyttien kationisten peptidien tai beetalaktaamiantibioottien aiheuttamasta lyysistä.

Gram-negatiivinen soluseinä:

Gram-negatiivisilla bakteereilla on ohuempi peptidoglykaanikerros (10 % soluseinästä), ja ne menettävät kristallivioletti-jodi-kompleksin alkoholin huuhtelulla tapahtuvan värinpoiston aikana, mutta säilyttävät vastavärjäyksen Safraninin, jolloin ne näkyvät punertavina tai vaaleanpunaisina. Niillä on myös ylimääräinen lipidejä sisältävä ulkokalvo, joka on erotettu soluseinästä periplasmisen tilan avulla.

Gramnegatiivisen soluseinän lääketieteellinen merkitys:

Gramnegatiivisten bakteerien soluseinä on usein virulenssia lisäävä tekijä, jonka avulla taudinaiheuttajabakteerit kykenevät aiheuttamaan sairauksia. Gramnegatiivisten bakteerien virulenssi liittyy usein tiettyihin soluseinän komponentteihin, erityisesti lipopolysakkaridiin ( tunnetaan myös nimellä LPS tai endotoksiini). Ihmisissä LPS saa aikaan synnynnäisen immuunivasteen, jolle on ominaista sytokiinituotanto ja immuunijärjestelmän aktivoituminen. Sytokiinituotannon seurauksena syntyy tulehdus, joka voi aiheuttaa myös isännän toksisuutta.

Stain Reaction:

Gram-värjäyksen neljä perusvaihetta ovat:

1) Primaarivärjäyksen kristallivioletin (CV) levittäminen lämpökiinnitettyyn bakteeriviljelyksen preparaattiin.

CV dissosioituu vesiliuoksissa CV+- ja Cl – -ioneiksi. Nämä kaksi ionia tunkeutuvat sitten sekä grampositiivisten että gramnegatiivisten solujen soluseinän ja solukalvon läpi. CV+ -ionit ovat myöhemmin vuorovaikutuksessa negatiivisesti varautuneiden bakteerikomponenttien kanssa ja värjäävät bakteerisolut violetiksi.

2) Gramin jodin lisääminen.

Jodi (I – tai I3 -) toimii peittausaineena ja pidättäjänä. Mordantti on aine, joka lisää soluseinän affiniteettia väriainetta kohtaan sitoutumalla primaariväriaineeseen ja muodostaen siten liukenemattoman kompleksin, joka jää soluseinään kiinni. Gram-värjäysreaktiossa kristallivioletti ja jodi muodostavat liukenemattoman kompleksin (CV-I), joka värjää preparaatin tumman violetiksi. Tässä vaiheessa kaikki solut muuttuvat violeteiksi.

3) Värinpoisto 95-prosenttisella etyylialkoholilla.

Alkoholi tai asetoni liuottaa gramnegatiivisten bakteerien lipidisen ulkokalvon, jolloin peptidoglykaanikerros jää näkyviin ja soluseinän huokoisuus kasvaa. CV-I-kompleksi huuhtoutuu tällöin pois ohuesta peptidoglykaanikerroksesta, jolloin gramnegatiiviset bakteerit jäävät värittömiksi.

Toisaalta alkoholilla on grampositiivisten bakteerien soluseiniin dehydratoiva vaikutus, joka saa soluseinän huokoset kutistumaan. CV-I-kompleksi sitoutuu tiukasti monikerroksiseen, voimakkaasti ristisilloittuneeseen grampositiiviseen soluseinään, jolloin solut värjäytyvät violetiksi.

Värinpoistovaihe on suoritettava varovasti, muutoin voi tapahtua liiallinen värinpoisto. Tämä vaihe on kriittinen, ja se on ajoitettava oikein, muuten kristalliviolettivärjäys poistuu grampositiivisista soluista. Jos värinpoistoaine levitetään soluun liian pitkäksi aikaa , grampositiiviset organismit näyttävät gramnegatiivisilta. Alivärjäytyminen tapahtuu, kun alkoholia ei anneta vaikuttaa tarpeeksi kauan, jotta CV-I-kompleksi huuhtoutuisi pois gramnegatiivisista soluista, jolloin gramnegatiiviset bakteerit näyttäisivät grampositiivisilta.

4) Vastavärjäys safraniinilla

Gramnegatiivisten solujen värinpoisto saadaan näkyviin sopivalla vastavärjäysaineella, joka on tavallisesti positiivisen varauksen omaava safraniini, joka värjää solut vaaleanpunaiseksi. Grampositiivisiin bakteereihin tarttuva vaaleanpunainen väri peittyy kristallivioletin purppuranpunaisella värillä (harvinaisissa tilanteissa käytetään joskus safraniinin sijasta perusfussiinia).