Syklaasiin assosioituneen proteiinin ja cofiliinin synergistisen aktiinifilamentin teräväkärkisten päiden depolymerisaation mekanismi

DNA-konstruktiot

Kaikki hiiren N-CAP-proteiinit, N-CAP-GFP, täyspitkä CAP1, HFD-domeeni, HFD-domeenin GST-fuusio ja twinfiliinin C-terminaalinen ADF-H-domeeni, kloonattiin pSUMOck4-bakteeri-ilmentymisvektoriin (ystävällinen lahja Inari Kursulalta, Bergenin yliopisto, Norja), jotta saatiin ekspressoitua SUMO:lla merkitty fuusioproteiini, joka jättää natiivin N-terminaalin sen jälkeen, kun se on pilkottu SENP2-proteaasilla. CARP-domeeni- ja C-CAP-konstruktioita varten käytimme pCoofy18-bakteeri-ilmentymisvektoria (ystävällinen lahja Addgenelta). Yksityiskohtaiset tiedot proteiinikonstruktioista ja alukkeista, joita käytettiin konstruktioiden kloonaamiseen, löytyvät lisätaulukosta 2.

Ekspressio ja puhdistus CAP-proteiinit ja sen fragmentit

Kaikki hiiren CAP-proteiinit ja sen fragmentit, lukuun ottamatta täyspitkää CAP1:tä, ekspressoitiin +22 °C:n lämpötilassa LB:n autoinduktioväliaineessa (AIMLB0210, Formedium) 24 tunnin ajan BL21(DE3)-BL21(DE3)-E. coli (Novagen).

Täyspitkä hiiren CAP1 ekspressoitiin LB-mediassa käyttäen ArcticExpress (DE3) E. coli -soluja. Ensin inokuloitiin kanamysiiniä (20 µg/ml) ja gentamysiiniä (20 µg/ml) sisältävä starttiviljelmä, jota inkuboitiin 6 tuntia +37 °C:ssa. 3,6 litran pääviljelmä, joka sisälsi vain kanamysiiniä (20 µg/ml), inokuloitiin ja kasvatettiin OD600-arvoon ~0,4 +37 °C:ssa ravistelemalla 240 rpm. Viljelylämpötila muutettiin +13 °C:een 1 h:n ajaksi ennen proteiiniekspressiota, joka indusoitiin lisäämällä 0,26 mM IPTG:tä 46 h:n ajaksi. Kaikki bakteeripelletit kerättiin sentrifugoimalla, resuspendoitiin 50 mM Tris-HCl:iin, 150 mM NaCl:iin, 25 mM imidatsoliin, pH 7,5:een, pakastettiin nestemäisellä N2:lla ja varastoitiin -80 °C:n lämpötilassa.

Kaikkien CAP-alkuperäisten geenimolekyylien (CAP:n) proteiinien ja kaksoiskudoksen kaksoiskudoksisten filosofisten proteiinien ADF-DH-vertailudomeenien (ADF-H-domeenien) puhdistus tehtiin samanlaista menetelmää käyttämällä. Ensin bakteerit lysoitiin sonikoimalla lysotsyymin (0,5 mg/ml), DNAse:n (0,1 mg/ml) ja proteaasi-inhibiittoreiden (200 µg/ml PMSF, 1 µg/ml leupeptiini, 1 µg/ml aprotiniini, 1 µg/ml pepstatiini A; kaikki Sigma-Aldrich) läsnä ollessa, ja lysaatti kirkastettiin sentrifugoimalla. Supernatantti ladattiin 1 ml:n HisTrap HP Ni-NTA -kolonniin (GE Healthcare) ja pestiin laajasti (>20 kolonnitilavuutta) 50 mM Tris-HCl:llä, 150 mM NaCl:lla, 25 mM imidatsolilla, pH 7,5. Proteiini eluoitiin 25-250 mM imidatsoligradientilla AKTA Pure -koneella (GE Healthcare). Huippufraktiot yhdistettiin ja SENP2-proteaasia lisättiin lopulliseen pitoisuuteen 40 µg/ml SUMO-tagin poistamiseksi. Seos dialysoitiin O/N 4 °C:ssa käyttäen SnakeSkin-dialyysiletkua 1 litrassa 20 mM HEPES, 300 mM NaCl, 2 mM DTT, pH 7,4 -puskuria. Seuraavana päivänä pilkotut SUMO-tagit poistettiin Ni-NTA-agaroosihelmillä (Qiagen) tapauksissa, joissa SUMO-tagin ja pilkotun proteiinin koko oli yhtä suuri. Proteiinit konsentroitiin Amicon Ultra-4 10 kDa:n sentrifugisuodattimella (Merck) ja ladattiin HiLoad 16/600 Superdex 200 -geelisuodatuspylvääseen (GE Healthcare), joka oli ekvilibroitu 5 mM:ssa HEPES:ää, 100 mM:ssa NaCl:ää, 1 mM:ssa DTT:tä, pH 7,4. Huippufraktiot kerättiin, konsentroitiin ja pakastettiin pikapakastamalla N2:ssa -80 °C:n säilytystä varten.

Täyspitkä CAP puhdistettiin seuraavin poikkeuksin. Käytimme 5 ml HisTrap HP Ni-NTA -kolonnia 1 ml:n kolonnin sijaan. Dialyysin ja HiLoad 16/60 Superdex 200 -geelisuodatuskolonnilla suoritetun geelisuodatuksen jälkeen suurimmat piikkifraktiot ajettiin Superose 6 increase 10/300 GL -geelisuodatuskolonnin läpi, jotta oligomeerien seos saatiin paremmin erotettua. Lopuksi useista ajoista saadut suurimmat piikit yhdistettiin, konsentroitiin 5 minuutin spin-intervallilla Amicon Ultra-4 30 kDa -sentrifugisuodattimella ja varastoitiin kuten edellä. CARP- ja C-CAP-proteiinit puhdistettiin kuten edellä, lukuun ottamatta 3C-proteaasin (0,01 mg/ml) käyttöä tagin pilkkomiseen.

Muut proteiinit

Kani-lihasaktiini, leimatut aktiinit, profiliini, hiiren kofiliini-1, capping-proteiini ja biotiini-gelsoliini valmistettiin kuten on kuvattu ref. 16. ADP-aktiini valmistettiin kuten on kuvattu ref. 34. Lyhyesti sanottuna 30 µM ATP-G-aktiiniliuosta, joka sisälsi 0,3 mM glukoosia ja 1 yksikköä/ml heksokinaasia (Sigma), dialysoitiin nukleotidinvaihtopuskuria (5 mM Tris-HCl, 0,1 mM MgCl2, 0,05 mM EGTA, 0,2 mM ADP, 1 mM DTT, pH 8,0) vasten 4 tunnin ajan 4 °C:ssa. Kaikissa kokeissa käytettiin kanin lihaksen α-aktiiniä.

Aktiinin teräväkärkisten päiden depolymerisaatiomääritykset

Aktiinifilamenttien teräväkärkisten päiden depolymerisaationopeuden mittaaminen suoritettiin mikrofluidiikkalaitteella, joka oli yhdistetty mikroskooppilaitteistoon, kuten kuvattu16. Lyhyesti sanottuna valmistimme kammion poly-dimetyylisiloksaanilla (PDMS, Sylgard), joka kiinnitettiin puhdistettuun peitelevyyn. Mikrofluidikkakammiot olivat 20 µm korkeita. Kolme sisääntuloaukkoa ja ulostuloaukko oli liitetty paineohjattuihin putkiin, jotka oli täytetty biokemialliselta koostumukseltaan erilaisilla liuoksilla (Fluigent-mikrofluidikkalaite).

Asennuksen jälkeen kammiot huuhdeltiin dH20:lla ja F-puskurilla (5 mM HEPES pH 7,4, 100 mM KCl, 1 mM MgCl2, 0,2 mM EGTA, 0,4 mM CaCl2, 0,2 mM ATP, 10 mM DTT ja 1 mM DABCO). Tämän jälkeen kammio altistettiin peräkkäin: 150 µl 0,1 % biotiini-BSA:ta F-puskurissa, 300 µl 5 % BSA:ta, 150 µl 3 µg/ml neutravidiinia F-puskurissa ja 10-100 µl 1-3 pM biotiini-gelsoliinia. Ennen kokeita aktiinifilamentit polymerisoitiin (8 µM, >30 min) F-puskurissa. Fraktio aktiinimonomeereistä leimattiin Alexa-488:lla tai 568:lla. Lopuksi filamentit ruiskutettiin kammioon ja ankkuroitiin peitinlippaaseen gelsoliinilla haluttuun tiheyteen.

Kofiliinillä koristeltujen teräväkärkisten päiden depolymerisaationopeuden mittaamiseksi filamentit kyllästettiin ensin 2 µM kofiliinillä ja altistettiin 2 µM kofiliinille, jota täydennettiin erilaisilla CAP-proteiineilla. Depolymerisaationopeus analysoitiin ImageJ:llä tekemällä ensin kymografia jokaisesta filamentista (funktion reslice) ja sovittamalla manuaalisesti kaltevuus pitkin terävää päätä. Filamentit, joiden teräviä päitä ei voitu selvästi seurata tai joissa oli mahdollisia (havaitsemattomia) taukoja53 tai katkaisutapahtumia, hylättiin analyysistä.

Voidaksemme minimoida proteiinimerkinnän vaikutuksen mittauksiimme käytimme joko 10 tai 16 %:n leimausfraktiota aktiinista riippuen mikroskooppiasetuksesta. Emme havainneet leimausfraktion vaikutuksia N-CAP-aktiivisuuteen kokeissamme. Kaikki kokeet suoritettiin huoneenlämmössä, ei-lämpötilakontrolloidussa kokoonpanossa.

Aktiinifilamenttien uudelleenliimautuminen

Valmiita, vakaan tilan F-aktiini-liuoksia (F-puskurissa), joissa oli eri fluoresoivia leimoja, sekoitettiin ja inkuboitiin uudelleenliimautumisen kvantifiointia varten. Sekoitettu liuos sisälsi 4 µM Alexa568-aktiiniä (10 % leimattu) ja 4 µM Alexa488-aktiiniä (10 % leimattu), N-CAP:n ja mutanttien kanssa tai ilman niitä. Kun F-aktiiniä oli pidetty 4 minuuttia huoneenlämmössä, sekoitettu F-aktiiniliuos laimennettiin 100 × puskurilla, jota oli täydennetty 0,2 % metyyliselluloosalla, ja se valutettiin avoimeen kammioon, joka oli tehty kaksipuolisella teipillä kahden peitelevyn väliin ja passivoitu BSA:lla. Kuvasarjat (2 s:n välein) otettiin vähintään kolmesta eri näkökentästä. Vihreiden (Alexa488) F-aktiinisegmenttien lukumäärä laskettiin sekä niiden segmenttien lukumäärä, jotka olivat yhteydessä punaiseen (Alexa568) F-aktiinisegmenttiin, jotta voitiin määrittää kahden värisegmentin suhde, joka on esitetty kuvassa 2f. Filamenttien diffuusion seuraamisen avulla voitiin määrittää yksiselitteisesti, milloin kaksi segmenttiä oli yhdistetty. Kontrollit (ilman N-CAP:tä F-aktiiniseoksessa) toistettiin useita kertoja ja kokeet (N-CAP:n tai mutanttien kanssa) vähintään kaksi kertaa.

Actin severing assays

Tutkittaessa N-CAP:n vaikutusta kofiliinin aiheuttamaan katkaisuun käytimme kahta erilaista menetelmää, joko (1) mittaamalla niiden yksittäisten kofiliinidomeenien osuutta, jotka eivät ole vielä johtaneet katkaisuun, tai (2) kvantifioimalla katkaisutapahtumien globaalia lukumäärää µm:n aktiinifilamenttia kohden.

(1) Yksittäisiin kofiliinidomeeneihin liittyvät katkaisut (Täydentävä kuva 3c). Noudatimme aiemmin kuvattua menettelyä16. Lyhyesti sanottuna mikrofluidisessa kammiossa 12 % Alexa-488-leimattuja aktiinifilamentteja polymerisoitiin spektriini-aktiini-siemenistä, jotka ankkuroitiin epäspesifisesti BSA-passivoituun peitelevyyn. Filamentteja vanhennettiin 15 minuutin ajan G-aktiiniliuoksella kriittisessä pitoisuudessa (100 nM G-aktiinia), jotta filamenteista tulisi >99 % ADP46. Tämän jälkeen filamentit altistettiin yhtäjaksoisesti 500 nM mCherry-kofiliini-1:lle yksinään, 2 µM:n täyspitkän CAP1:n kanssa tai 10 µM:n N-CAP:n kanssa. ImageJ:llä rakennettiin sitten kymografioita filamenteista, jotta voitiin seurata yksittäisten kofiliinidomeenien ydintymistä ja kokoonpanoa sekä katkeamistapahtumia rajapinnassa paljaiden aktiinisegmenttien kanssa.

Kullekin domeenille määriteltiin aika 0 siinä kehyksessä, jossa ne ydintyivät. Tämän jälkeen kirjasimme joko ajan, jolloin ne indusoivat katkaisutapahtuman, tai kun ne häviävät toisen domeenin katkaisun, yhdistymisen tai sensoritapahtuman vuoksi. Sen jälkeen laskettiin niiden domeenien osuus, jotka eivät aiheuttaneet katkaisutapahtumaa, käyttäen klassista Kaplan-Meier-menetelmää.

(2) Katkaisutapahtumien kokonaismäärä/µm (Täydentävä kuva 3d). Virtauskammioiden sisälle (kahden kaksipuolisella teipillä väliin asetetun peitelevyn väliin) ruiskutimme ensin esipolymeroituja Alexa-488-leimattuja filamentteja (F-puskurissa, jossa oli 0,2-0,3 % metyyliselluloosaa). Tämän jälkeen liuos vaihdettiin 500 nM:lla leimaamatonta cofilin-1:tä ja 0, 1 tai 10 µM NCAP:tä. Vaihdon jälkeen pinnan lähelle jääneet filamentit analysoitiin seuraavasti.

Katkaisutapahtumien määrä µm:ä kohti laskettiin kumulatiivisena funktiona

joissa Nsev(u) on katkaisutapahtumien lukumäärä ajankohtana u ja \(\mathop {\sum}\nolimits_i {l_{i(u)}}}\) on kaikkien säikeiden i pituuksien summa ajankohtana u. Koska liuos ei sisällä G-aktiiniä, filamentit depolymerisoituvat ja filamenttien pituus siten pienenee ajan myötä.

N-CAP:n sitoutuminen filamenttien teräviin päihin

Koe suoritettiin virtauskammioissa (ks. Aktiinin katkaisutesti (2)), jotka passivoitiin biotiini-PLL-PEG:llä ja funktionalisoitiin neutravidiinilla. F-aktiini (10 % Alexa-568, 1 % biotiinia) polymerisoitiin yön yli 4 µM:ssa. Juuri ennen kammioon injektointia F-aktiini laimennettiin 200 nM:iin ja sekoitettiin 100 nM N-CAP-GFP:n, 2 µM cofilin-1:n ja 4 nM:n korkkiproteiinin kanssa F-puskurissa, jota täydennettiin 0,2 % metyyliselluloosalla. Kuvat aktiinifilamenteista otettiin ennen ja jälkeen GFP-kanavan virranoton (5 kuvaa/sekunti 12 sekunnin ajan, TIRF-mikroskopia). Filamenttien päihin sitoutumisen analysointia varten valittiin sokeasti aktiinifilamentit, jotka eivät liikkuneet stream-kuvauksen aikana. Fluoresenssi mitattiin kunkin filamentin molemmista päistä 3 x 3 pikselin kokoiselta alueelta. Sitoutumistapahtuma havaittiin, kun fluoresenssi ylitti mielivaltaisen kynnysarvon (sama arvo kaikille filamenteille ja filamenttien päille). Koska peiteproteiinin pitäisi suojata piikkipäätä, terävämpi pää katsottiin sellaiseksi, jossa oli eniten sitoutumistapahtumia. N-CAP-GFP havaittiin 17 prosentissa datapisteistä filamentin teräväkärkisessä päässä, kun taas N-CAP-GFP:n epäspesifinen assosiaatio filamentin piikkipään läheisyydessä havaittiin 1,7 prosentissa datapisteistä. Tämän jälkeen laskettiin N-CAP:n eloonjäämisfraktio teräväkärkisessä päässä ja sovitettiin yhden eksponentiaalin avulla sitoutumattomuusnopeuden mittaamiseksi.

Kiteytys ja rakenteen määritys

Hiiren HFD-domeeni kiteytettiin, kun siinä oli mukana 10×His-tag, ja puhdistettiin kuten edellä on kuvattu lukuun ottamatta sitä, että käytettiin geelifiltraatiossa puskuria, jossa oli 5 mM HEPES, 50 mM NaCl, 0,2 mM DTT, 0,01 % NaN3:aa, pH 7,5. Näyte konsentroitiin 7-10 mg/ml:ksi ennen kiteytystä ja sekoitettiin 1:1 0,1 M natriumkakodylaattiin, 12 % PEG4000 (w/v), pH 6,1:een istuvalla pisaramenetelmällä, jossa pisarakoko oli 200 nl 96-kuopan muodossa. Kahden viikon inkuboinnin jälkeen havaittiin suuria neulamaisia kiteitä. Diamond Light Source -lähteessä (UK, Didgot) sädelinjalla I03 tapahtuvaa etädatan keräämistä varten kiteet kryosuojattiin liottamalla ne 25 % glyserolia sisältävään emonesteeseen ja pakastettiin N2:ssa sädelinjalle kuljetusta varten. Tiedot kerättiin 100 K:n lämpötilassa käyttäen 0,9763 Å:n aallonpituutta, Pilatus3 6M -ilmaisinta, 30 prosentin lähetystehoa, 0,05 sekunnin valotusta ja 0,1°:n värähtelykulmaa yhteensä 2400 kuvana. Diffraktiotiedot integroitiin ja skaalattiin X-ray Detector Software (XDS)54 -ohjelmistolla. Alkuperäinen ratkaisu saatiin molekyylikorvauksella käyttäen PHASER55 -ohjelmaa ja hakumallina PDB = 1s0p. Löydettiin ratkaisu, jossa oli neljä HFD-domeenia epäsymmetrisessä yksikössä, minkä jälkeen useilla tarkennuskierroksilla BUSTER-ohjelmalla56 ja manuaalisella rakentamisella COOT-ohjelmalla57 saatiin hyvä sovitus dataan (ks. taulukko 1). Parannusta saatiin edelleen tarkentamalla tietoja ottamalla käyttöön translaatio-liberaatio-ruuvi -parametrit (1/ketju), poistamalla ei-kiteiset rajoitukset ja mallintamalla yksittäisten atomien B-kerroin. Mallin lopullinen Rwork/Rfree oli 18,6 %/23,0 %, ja kokonaisgeometria oli hyvä.

Kolmiokompleksin (ADP-aktiini, hiiren CAP1:n HFD-domeeni ja hiiren twinfilin-1:n C-terminaalinen ADF-H-domeeni) kiteyttämistä varten ADP-aktiini valmistettiin O/N-dialyysissä +4 °C:n lämpötilassa sulatusmenetelmällä, jossa ADP-aktiini valmistettiin 5 mM:ssa HEPES:iä, 0 .2 mM MgCl2, 0,2 mM ADP, 0,2 mM EGTA, 0,3 mM glukoosi, 0,5 mM β-merkaptoetanoli, pH 8,0. Aktiiniliuos, joka sisälsi 0,3 mM glukoosia ja 5 U/ml heksokinaasia, siirrettiin Slide-A-Lyser-dialyysimembraanille ja laitettiin kelluntalaitteeseen +4 °C:ssa. Seuraavana päivänä ennen kompleksinmuodostusta aktiini sentrifugoitiin 20 minuutin ajan 355 040 × g:ssa TLA-120-roottorilla. Proteiinit sekoitettiin suhteessa 1:1,1:1,1 (aktiini, HFD-domeeni, ADF-H-domeeni), konsentroitiin 10-20 mg/ml:ksi ja käytettiin kiteytykseen kuten edellä. Osumia saatiin useista eri olosuhteista, ja parhaiten diffraktioiva kide saatiin ~10 mg/ml:n konsentraatiolla kompleksista, joka sekoitettiin 1:1 0,1 M HEPES:iin, 0,1 mM KCl:iin, 10 %:iin PEG4000:sta (w/v), pH 7,0:ssa istumapisaran ollessa 200 nl. Ensimmäisenä päivänä pisaraan ilmestyi useita pieniä timantinmuotoisia kiteitä. Kolmantena päivänä ilmestyi suuri sauvamainen kide, kun kaikki pienet kiteet olivat liuenneet. Diamond Light Source -lähteen (UK, Didgot) sädelinjalla I03 tapahtuvaa etädatan keräämistä varten kiteet kryosuojattiin liottamalla niitä LV CryoOil -öljyssä (MiTeGen) ja pakastettiin N2:ssa kuljetusta varten. Tiedot kerättiin 100 K:ssa käyttäen 0,9762 Å:n aallonpituutta, Pilatus3 6M -ilmaisinta, 20 prosentin lähetystehoa, 0,05 sekunnin valotusta ja 0,15°:n värähtelykulmaa yhteensä 2400 ruutua. Diffraktiodata integroitiin ja skaalattiin XDS54-ohjelmalla. Alustava ratkaisu saatiin molekyylikorvauksella käyttäen PHASER55 ja hakumallina PDB = 3daw, joka osoitti selvää ylimääräistä tiheyttä aktiinimonomeerin teräväkärkisessä päässä. Niinpä suoritettiin toinen molekyylien korvaaminen, ja kolmikompleksin alustava malli saatiin käyttämällä BALBES58 -ohjelmaa, jossa hakumalleina olivat 3daw ja 1s0p. Näin saatiin ratkaisu, jonka Q = 0,787 ja Rwork/Rfree = 29,7 %/35,6 %. Epäsymmetrinen yksikkö sisälsi yhden 1:1:1 kompleksin HFD:ADF-H:ADP-aktiini. Mallin parantamiseksi tarvittiin useita tarkennuskierroksia BUSTER-ohjelmalla56 ja manuaalista rakentamista COOT-ohjelmalla57 , erityisesti D-silmukan ja HFD-domeenin α-heliksien yhdyssilmukoiden uudelleenrakentamista. Lopulta vesien lisääminen, translaatio-libration-screw-parametrien (1/ketju) käyttöönotto ja yksittäisten atomien B-faktoreiden mallintaminen tuottivat mallin, jonka lopullinen Rwork/Rfree oli 16,6 %/19,4 % ja jossa oli hyvä kokonaisgeometria.

Proteiini-proteiini-vuorovaikutusten tutkiminen geelifiltraatiolla

Aktinin monomeerin kiinnittymisen tutkimista varten valmistettiin ADP-G-aktiini kuten on kuvattu ref. 34. Kaikki geelisuodatuskokeet suoritettiin +4 °C:ssa 0,5 ml/min juoksunopeudella ja 0,5 ml:n fraktioinnilla Superdex 200 increase 10/300 GL -geelisuodatuskolonnilla, joka oli ekvilibroitu 5 mM:ssa HEPES:ää, 100 mM:ssa NaCl:a, 0,1 mM:ssa ADP:tä, 0,1 mM:ssa MgCl2:ta, 1 mM:ssa DTT:tä, pH 7,4. Sata mikrolitraa kompleksia, joka sisälsi 18 µM twinfiliinin ADF-H-domeenia ja 15 µM muita proteiineja, ruiskutettiin pylvääseen ja analysoitiin eluution osalta. Huippufraktiot analysoitiin myös SDS-PAGE:lla. Aktiinimonomeerikilpailukokeet suoritettiin kuten edellä, lisäämällä näytteisiin 15 µM C-CAP- tai CARP-domeenia. Huippufraktiot analysoitiin SDS-PAGE:lla, geelit kuvattiin ChemiDoc XRS + -kuvantamisjärjestelmällä (Bio-Rad) ja kvantifioitiin Image Labilla (Bio-Rad).

Native-PAGE

Mini-Protean TGX 10 %:n geelit (Bio-Rad) esijuoksutettiin jäähdytetyssä juoksutuspuskurissa (25 mM Tris, 195 mM glysiini, 0,5 mM ADP, 0,1 mM MgCl2, pH 8,5) 1 tunnin ajan ennen lataamista. Näytteet valmistettiin ADP-aktiini-dialyysipuskurissa (5 mM HEPES tai Tris, 0,1 mM MgCl2, 0,1 mM EGTA, 0,2 mM ADP, 0,3 mM glukoosi, 0,1 mM DTT, pH 8.0) 20 µM:n pitoisuudella kutakin proteiinia, sekoitetaan suhteessa 1:1 2 × latauspuskuriin (juoksutuspuskuri, joka sisältää 20 % glyserolia, bromifenolisinistä, ei ADP:tä eikä MgCl2:ta) ja levitetään sitten 5 µl:n tilavuus 50 µl:n näytekuoppiin. Geelit ajettiin 100 V:n jännitteellä jäällä 4 h.

Fluorometrinen aktiinifilamenttien purkautumisen määritys

ADP-aktiinifilamenttien vakaan tilan purkautuminen suoritettiin seuraavasti: 20 mM HEPES, 100 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 1 mM ATP, 1 mM DTT, pH 7,4 60 minuutin ajan. Filamentin piikkipäät peitettiin 50 nM peittoproteiinilla. Tämän jälkeen lisättiin 0,5 µM kofiliinia (ja 0,5 µM N-CAP) ja reaktio käynnistettiin lisäämällä 4 µM D-vitamiinia sitovaa proteiinia (monomeerin sekventoiva aine). Aktiinin lopullinen pitoisuus oli 2,5 µM. Aktiinin hajoaminen mitattiin seuraamalla pyreenin fluoresenssia, jonka heräte oli 365 nm:ssä ja emissio 407 nm:ssä fluoresenssispektrofotometrillä (Agilent) 2400 s ajan 22 °C:ssa.

CD-spektrometria

N-CAP:n villityypin, mutanttien ja HFD-domeenin CD-spektrit mitattiin 20 °C:ssa J-720-spektropolarimetrillä (Jasco) 300 µl:n kvartsikyvetissä, jonka valon kulkureitin pituus oli 0,1 cm, seuraavilla parametreilla: jatkuva skannaustila skannausnopeudella 50 nm/min, kaistanleveys 0,5 nm, aaltoalue 190-260 nm, datan jako 0,5 nm. Kaikki proteiinit laimennettiin 15 µM:iin 10 %:n PBS-puskurilla. Kymmenen skannauksen kertymä kullekin proteiinille on piirretty yhtenä käyränä.

Mallit atomistisia MD-simulaatioita varten

Kofiliinillä koristellun aktiinin mallit perustuivat 3,8 Å:n resoluutiolla olevaan kryoelektronimikroskooppirakenteeseen (PDBID: 5YU8)41. Puuttuvat silmukat rakennettiin RosettaCM59- ja RosettaScripts60 -ohjelmilla käyttäen elektronitiheyskarttaa41 , joka pakottaa niihin liittyvän kierteisen symmetrian. Jotta tässä työssä käytetyt koekonstruktiot vastaisivat kokeellisia konstruktioita, aktiini- ja kofiliinisekvenssit vaihdettiin tässä vaiheessa kanan sijasta kanin ja hiiren sijasta hiiren sekvensseihin. Malleja luotiin yli 1000 kappaletta. Sitten ne lajiteltiin niiden kokonaispistemäärän perusteella, ja rakenteellisia artefakteja (esim. cis-peptidisidoksia) sisältävät mallit suodatettiin pois. Molekyylidynamiikan (MD) simulaatiot aloitettiin kolmesta eniten pisteitä saaneesta mallista (lisätaulukko 1, simulaatiot F1-3).

HFD-aktiini-kompleksi eristettiin kiteytetystä HFD-domeeni/aktiini/twinfiliini ADF-H-domeenikompleksista ja telakoitiin erikseen edellä kuvattuihin valittuihin kofiliinillä koristeltuihin aktiinifilamenttimalleihin. Tätä tarkoitusta varten eristetty HFD-aktiini asetettiin päällekkäin kunkin teräväkärkisen aktiinimonomeerin kanssa, joka sitten korvattiin HFD-aktiinilla. Tällä tavoin aktiini-HFD-dimeerin kiderakennekonformaatio siirretään kofiliinillä koristellun aktiinin kärkeen. Telakoidut mallit tarkennettiin ensin paikallisesti käyttäen telakointiprotokollaa61 , minkä jälkeen ne relaksoitiin rajoitetusti Rosetta Software Suite -ohjelmiston mukana jaetulla fast relax62 -protokollalla. Tätä prosessia sovellettiin erikseen kullekin MD-simulaatioihin valitulle kofiliinikoristetulle aktiinifilamentille (lisätaulukko 1, simulaatiot C1-3).

Kärkipään segmentin rakentaminen MD-simulaatioita varten

Jokainen simulaatio suoritettiin valitun kofiliinikoristellun aktiinifilamenttimallin pistemäiselle päätepätkälle, joka luotiin viipaloimalla malli kohtisuoraan filamentin akselia vastaan. Viipalointitaso valittiin siten, että segmenttiin sisältyi neljä kokonaista ADP-Mg2+ -sidottua aktiinimonomeeria ja kolme kokonaista kofiliinimonomeeria (lisätaulukko 1, simulaatiot F1-3). Segmentti sisälsi myös kaksi HFD-domeenia teräväkärkisessä päässä HFD:hen sitoutuneissa järjestelmissä (lisätaulukko 1, simulaatiot C1-3). Teräväkärkinen segmentti sisälsi myös useita polypeptidifragmentteja kofiliineistä ja aktiineista sen piikkipäässä (Täydentävä kuva 5a). Jotta niiden konformaatio ja asento säilyisivät simulaatioiden aikana, nämä katkenneet ketjut pidettiin paikallaan koko simulaatioiden ajan seuraavasti: Kerros jäännöksiä rajapinnassa teräväkärkisen loppusegmentin muuhun osaan jätettiin vapaaksi; kaikki raskaat atomit lähellä viipalointitasoa ja vain selkärangan raskaat atomit niiden väliin jäävillä alueilla rajoitettiin voimavakiolla 100 kJ/mol/nm2 (Täydentävä kuva 5a). Nämä osittain rajoitetut polypeptidifragmentit toimivat piikkipäässä alustana simulaatioiden aikana. Tämä lähestymistapa säilyttää sekä filamentin kaltaisen proteiini-proteiini-rajapinnan piikkipäässä että filamentin orientaation simulaatioiden aikana.

Jäämien protonoitumistilat määritettiin neutraalissa pH:ssa pKa-laskelmien perusteella PROPKA363:n avulla. Jokainen aktiinin H73-jäännös metyloitiin (Nτ-metyyli-l-histidiini, HIC), ja aktiinin, kofiliinin ja HFD:n N-päätteet asetyloitiin. Jokaisen systeemien molekyylin topologiat laadittiin ambertools1864:n mukana jaetulla LeAP-ohjelmalla, jotka sitten muunnettiin GROMACS-muotoon ParmEd-työkalun avulla.

Jokainen valituista malleista luotu teräväkärkinen pääteviipale sijoitettiin kuusikulmaiseen prisman simulointilaatikkoon siten, että sen pituusakseli oli linjassa z-akselin kanssa. Laatikon mitat valittiin siten, että filamentin ja laatikon jokaisen sivun välinen vähimmäisetäisyys oli noin 17 Å (lisätaulukko 1). Kukin systeemi liuotettiin 0,15 M NaCl-liuoksella, jossa ionien lukumäärät oli säädetty systeemin neutraloimiseksi.

Ennen tuotantoajoja suoritettiin jyrkimmän laskeutumisen minimointi ja peräkkäiset lyhyet tasapainosimuloinnit (yhteensä ~7 ns) NVT- ja NpT-kokoonpanoissa käyttäen Berendsenin termostaattia ja barostaattia65 . Näiden tasapainotussimulaatioiden aikana terävään pääteviipaleeseen sovellettiin harmonisia sijaintirajoituksia. Pienempi joukko atomeja (kaikki raskasatomit, proteiinin selkäranka ja lopulta vain Cα-atomit) rajoitettiin jokaisessa peräkkäisessä ekvibrointisimulaatiossa voimavakiolla 1000 kJ/mol/nm2.

Systeemit, jotka haarautuivat muista (täydentävä taulukko 1; C1′, C2′. F2′) valmistettiin tekemällä sopiva muutos (telakoimalla tai poistamalla HFD-domeenit), poistamalla päällekkäiset liuotinmolekyylit (kun HFD-domeenit telakoitiin) ja säätämällä laatikkokoko ja liuotinatomit uudelleen uutta järjestelmäkokoa varten. Vaiheittainen NVT- ja NpT-tasapainotus rajoituksineen suoritettiin edellä mainitulla tavalla (yhteensä ~200 ps simuloinneissa, joissa HFD-domeenit poistettiin, ja yhteensä ~4 ns simuloinneissa, joissa HFD-domeeni on telakoituna).

Kaikki tuotantoajot suoritettiin 1-2.5 μs:n ajan NpT-ensemblessä käyttäen ainoastaan edellä mainittuja alustan alueen sijaintirajoituksia.

Voimakentät ja parametrit MD-simulaatioissa

MD-simulaatioissa käytettiin seuraavia voimakenttiä ja parametrisarjoja: Amber ff14sb66 proteiineille, TIP3P-malli67 vedelle, Joungin ja Cheathamin68 monovalentti-ionien parametrisarja Na+:lle ja Cl-:lle, Saxenan ja Septin69 oktaedrinen multisite-ionimalli Mg2+:lle ja Meagherin ym.70 polyfosforyloidun yhdisteen parametrisarja ADP:lle. Metyyli-histidiinin (Nτ-metyyli-l-histidiini, HIC) puuttuvat sidosparametrit otettiin GAFF2-voimakentästä64. Atomivaraukset laskettiin Duan et al.71 Duan et al.71 R.E.D.III.5 -ohjelmistoa72 käytettiin monimuodostumaisen rajoitetun sähköstaattisen potentiaalin (RESP) sovittamiseen käyttäen HIC-dipeptidin (Ace-HIC-Nme) laajennettua ja α-helikaalista konformaatiota. Kaikki kvanttikemialliset laskelmat tehtiin käyttäen Gaussian09-ohjelmapakettia73 b3LYP/cc-pVTZ-teoriatasolla. Varauslaskelmat suoritettiin IEFPCM-mallilla polarisoituvassa jatkumossa, jonka dielektrisyysvakio on 4, asettamalla liuottimeksi eetteri.

MD-simulointiprotokollat

Kaikki simuloinnit suoritettiin GROMACS 2018 -ohjelmalla74. Liikeyhtälöt integroitiin käyttäen leap-frog-algoritmia 2 fs:n aika-askeleella. Kaikki sidokset rajoitettiin LINCS-algoritmilla75. Simulointiprotokollat valittiin ref. 66. Pitkän kantaman sähköstaattiset vuorovaikutukset käsiteltiin sileän hiukkasverkon Ewald-skeemalla76 , jossa reaaliavaruuden rajaus oli 0,8 nm, Fourier-väli 0,12 nm ja neljännen asteen interpolointi. Van der Waalsin vuorovaikutuksiin käytettiin Lennard-Jonesin potentiaalia, jonka raja on 0,8 nm. Pitkän kantaman dispersiokorjauksia käytettiin energian ja paineen77 osalta.

Kaikki tuotantosimulaatiot suoritettiin NpT-kokoonpanossa. Kärkipään siivu, alusta ja liuotin (vesi ja 0,15 M NaCl) kytkettiin erillisiin lämpötilakylpyihin 310 °K:n lämpötilassa käyttäen Nosé-Hooverin termostaattia78,79 aikavakion ollessa 1,0 ps. Isotrooppinen painekytkentä suoritettiin käyttämällä Parrinello-Rahman-barostaattia80 , jonka referenssipaine oli 1 atm, aikavakio 5 ps ja kokoonpuristuvuus 4,5 × 10-5 bar-1.

MD-simulaatioiden analysointi

Kaikki analyysit suoritettiin käyttäen VMD:tä81 ja talon omia skriptejä. MMGBSA-laskelmat suoritettiin ambertools1864 -ohjelmiston mukana jaetulla MMPBSA.py-ohjelmistolla82 käyttäen Onufrievin et al. kehittämää modifioitua GB-mallia83 . 0,15 M suolakonsentraatiolla (100 ns:n välein poimitut kehykset, joista hylättiin kunkin simulaation ensimmäiset 500 ns).

Rakenneanalyysit

Kuvassa 1d esitettyjen eri aktiinirakenteiden ja niiden konformaatiotilojen analysoinnissa noudatimme Tanaka ym.41,84:n protokollaa. käyttäen referenssinä F-aktiinirakennetta (PDB 6djo).

Statistinen analyysi ja toistettavuus

Kuvissa 2d, 4b ja 4d esitetyt tiedot yhdistettiin useista eri päivinä tehdyistä kokeista, joten ne edustavat useiden riippumattomien kokeiden tietoja. Taulukoissa 2f, 2g, 2h ja 3d esitetään tiedot, jotka on analysoitu yhdestä edustavasta kokeesta. n kuvaa analysoitujen filamenttien lukumäärää taulukoissa 2d, 2f, 2g, 4b ja 4d. Taulukon 6c n vastaa kokeiden suorituskertojen lukumäärää.

Lisäkuvissa 2a-d, 3c, 6a-d esitetyt kokeet suoritettiin samankaltaisina tuloksin vähintään kaksi kertaa. Kokeet kuvassa 3d, CARP-domeenin kilpailukoe kuvassa 6a ja kokeet kokoonpanoa edistävissä olosuhteissa kuvassa 7 suoritettiin kerran.

Raportointiyhteenveto

Lisätietoa tutkimussuunnittelusta on saatavissa tähän artikkeliin linkitetystä Nature Research Reporting Summary -julkaisusta.