Straptococcus pyogenes -kannat, jotka ovat peräisin Severe Invasive Infections Bind HEp2 and HaCaT Cells More Avidly than Strains from Uncomplicated Infections

Streptococcus pyogenes (A-ryhmän streptokokki ) on etiologinen aiheuttaja moninaisille ihmisen sairauksille, mukaan lukien nielutulehdus, pyoderma ja vakavat invasiiviset sairaudet. Lisäksi taudinaiheuttaja liittyy mahdollisesti hengenvaarallisiin jälkitauteihin, kuten streptokokin jälkeiseen glomerulonefriittiin ja akuuttiin reumakuumeeseen. Australian pohjoisella alueella (Northern Territory, NT) akuutin reumakuumeen esiintyvyys on erittäin korkea alkuperäisväestön keskuudessa (3), vaikka GAS:n eristysaste kurkussa on alhainen. Lisäksi GAS-infektiosta johtuva pyoderma on erittäin yleinen, ja poststreptokokki-glomerulonefriitti on endeeminen monissa syrjäisissä aboriginaaliyhteisöissä (4, 7). Invasiiviseen tautiin liittyvien kantojen raportoitu reservuaari on usein oireeton kulkeutuminen kurkussa (5), mutta populaatioissa, joissa impetigo on endeeminen, kuten syrjäisten alueiden aboriginaaliyhteisöissä, ensisijainen reservuaari on iho. Riippumatta siitä, mikä kudos on ensisijainen infektiopaikka, patogeenin on ensin kiinnittyminen isäntäsoluihin. S. pyogenes -bakteerin genomi koodaa lukuisia geenejä, joiden voidaan katsoa koodaavan adhebiineja. Nämä geenit ovat hyvin säänneltyjä, eikä yksittäisillä kannoilla ole geneettistä potentiaalia koodata kaikkia näitä proteiineja. Adhesiineihin kuuluvat M-proteiini (antifagosyyttinen molekyyli), kapseli ja fibronektiinia sitovat proteiinit. Fibronektiinia sitovia proteiineja on monia erilaisia, kuten SfbI (8, 12), PrtF2 (9, 10), Fbp54 (2) ja SfbII (11). Yksittäisen kannan adheesiokyky voi vaihdella sen mukaan, millainen adheesiinejä tuottavien geenien repertuaari kannalla on ja mikä on niiden ilmentymistaso. Tämä puolestaan voi heijastaa eroja kyvyssä kolonisoitua ja infektoida pysyvästi eri kudospaikkoja. Tästä seuraa, että eri kudospaikoista peräisin olevilla isolaateilla voi olla eroja tarttumiskyvyssä. Tämän testaamiseksi olemme määritelleet ihosta, kurkusta ja verestä peräisin olevien GAS-isolaattien sitoutumisen laajuuden HEp2- ja HaCaT-solulinjoihin, jotka edustavat ihmisen kurkunpään epiteelisoluja ja keratinosyyttejä.

Neuvosta kerättiin GAS-isolaatteja vuosien 1990 ja 2002 välillä. Tässä tutkimuksessa analysoidut 72 kantaa eristettiin verestä (n = 26), ihosta (n = 22) ja kurkusta (n = 24) (taulukko 1). Verestä eristetyt kannat olivat peräisin vakavasta taudista, ja loput kannat olivat peräisin komplisoitumattomista infektioista. Isolaatit tyypitettiin Vir-tyyppisesti aiemmin kuvatulla tavalla (6). Vir-tyypitykseen liittyy mga-regulonin rajoitusfragmenttipituuspolymorfismi, joka sisältää erittäin vaihtelevan M-proteiinin geenin. Sen varmistamiseksi, että mukaan otettiin epidemiologisesti toisistaan riippumattomia kantoja, mukaan otettiin yksi edustava isolaatti kustakin Vir-tyypistä. Viljelmiä kasvatettiin yön yli 37 °C:ssa orbitaalisessa ravistimessa stationaarivaiheeseen Todd-Hewitt-liemessä (Oxoid, Basingstoke, Yhdistynyt kuningaskunta), jota täydennettiin 1 prosentin hiivauutteella. GAS-inokulumin valmistamiseksi tarttuvuusmäärityksiä varten yön yli kestäneet viljelmät sentrifugoitiin, ja pelletit pestiin fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS; Life Technologies Gibco BRL, New York, N.Y.) ja suspendoitiin uudelleen seerumittomassa ja antibiootittomassa RPMI 1640 -mediassa (Life Technologies) siten, että optinen tiheys 600 nm:ssä oli 0,05. Tämä vastaa noin 1 × 107-1,5 × 107 bakteeria millilitrassa.

Ihmisen kurkunpään epiteelisoluja (HEp2) ylläpidettiin RPMI 1640 -mediassa, jota oli täydennetty 10 %:lla vasikan sikiöseerumilla (Life Technologies), 1 %:lla Fungizonea (Life Technologies), 20 μg vankomysiini-HCl:ää (David Bull Laboratories, Sydney, Australia) millilitrassa ja 100 μg streptomysiinisulfaattia (Sigma, St. Louis, Mo.) millilitrassa. Ihmisen aikuisen ihon keratinosyytit (HaCaT-solut) pidettiin Dulbeccon modifioidussa Eagle-mediassa (Life Technologies), jota täydennettiin 10 %:lla lämpöinaktivoidulla vasikan sikiöseerumilla. Adheesiomäärityksiä varten ∼105 solua/ml kylvettiin halkaisijaltaan 12 mm:n läpimittaisille lasipeitelevyille 24 kuopan kudosviljelylevyjen (Nunc, Roskilde, Tanska) pohjiin. Kun soluja oli kasvatettu yön yli 37 °C:ssa 5 %:n CO2-ilmakehässä, ne pestiin PBS:llä (pH 7,4) ja inokuloitiin 500 μl:lla GAS-rokotetta. Kun soluja oli inkuboitu 2 tuntia 37 °C:ssa, peitinlasit pestiin viisi kertaa lisäämällä 1 ml PBS:ää kuhunkin kuoppaan, ja varovaisen sekoittamisen jälkeen pesuliuos poistettiin imemällä. Kun kiinnittymättömät bakteerit oli poistettu, isäntäsolut ja kiinnittyneet bakteerit kiinnitettiin 95-prosenttisella metanolilla ja ilmakuivattiin. Lämpökiinnityksen jälkeen peitinlasit asetettiin objektiolevyille ja ne värjättiin Gram-värjäystä varten öljyimmersiota varten. Kussakin kokeessa analysoitiin soluja useista satunnaisista kentistä, ja kiinnittyminen ilmaistiin GAS-ketjujen keskimääräisenä lukumääränä solua kohti. Kaikki kokeet tehtiin kahtena kappaleena, ja keskimääräinen sitoutuminen määritettiin kullekin kannalle. Kaikki tilastolliset analyysit tehtiin Stata Statistics/Data Analysis -ohjelman versiolla 7.0 (Stata Corporation, College Station, Tex.). Tiedot analysoitiin t-testeillä.

GAS-kannat kiinnittyivät molempiin solutyyppeihin, ja sitoutumisaste vaihteli kannasta toiseen (taulukko 1). Riippumattomien kokeiden välillä, joissa 20 isolaattia toistettiin kahdella aikavälillä, oli hyvä korrelaatio (tietoja ei ole esitetty), mikä viittaa siihen, että sitoutumisen aviditeetti on toistettavissa ja kantaspesifinen. Kaiken kaikkiaan GAS:n sitoutuminen HaCaT-soluihin on suurempaa kuin HEp2-soluihin (P < 0,05). Kun taulukossa 1 esitetyt tiedot erotettiin eristyspaikan kudospaikan perusteella, verestä peräisin olevien GAS-kantojen keskimäärin 270 ketjua sitoutui 50 HaCaT-soluun (kuva 1). Sitä vastoin ihon ja kurkun isolaatit sitoivat keskimäärin vain 169 ja 178 ketjua 50 HaCaT-solua kohti. Nämä erot ovat tilastollisesti merkitseviä (P = 0,0044 ja 0,0063). Mielenkiintoista on, että HEp2-solujen osalta erot eivät ole yhtä selviä eivätkä tilastollisesti merkitseviä. Kun tiedot kuitenkin analysoitiin uudelleen invasiivisten ja komplisoitumattomien infektioiden perusteella yhdistämällä ihon ja kurkun isolaattien tiedot, molemmissa solulinjoissa havaittiin merkitseviä eroja näiden kahden luokan välillä (P = 0,0011 HaCaT-solulinjalla; P = 0,0238 HEp2-solulinjalla).

Tämän laboratorion aiemmat tutkimukset osoittivat, että monet yleisesti levinneet S. pyogenes -bakteerikannat voivat aiheuttaa invasiivisia tauteja, joissa ensisijaisena infektiokohtana on iho (1). Nämä havainnot ovat yhdenmukaisia nykyisten havaintojen kanssa, joiden mukaan NT GAS -kannat ovat avidimpia HaCaT- kuin HEp2-solulinjoille ja veri-isolaatit kykenevät sitoutumaan suurempaan määrään kuin komplisoitumattomista infektioista saadut isolaatit. Mahdollisia selityksiä S. pyogenes -veri-isolaattien korkealle adheesioalttiudelle ovat invasiivisista ja ei-invasiivisista tautilähteistä peräisin olevien isolaattien väliset genotyyppiset ja fenotyyppiset erot. Lisätutkimuksia tarvitaan tämän sitoutumisaviditeetin luonteen määrittelemiseksi ja sen selvittämiseksi, onko se johdonmukaista kloonipopulaatioiden sisällä.