Tämä luku liittyy epämääräisesti vuoden 2017 CICM Primary Syllabusin E(iv) jaksoon, jossa kokelaan odotetaan ”kuvaavan solunsisäisen nesteen koostumusta”. Koska tämä on solufysiologiaa käsittelevä jakso, tässä keskitytään pääasiassa organisaation mikrotasoon, ja kaikki solunsisäistä kehon nestekompartimenttia koskeva keskustelu jätetään kehon nesteitä käsittelevään jaksoon.
Se, että korkeakoulututkinnon vastaanottajat eivät ole koskaan kiinnittäneet huomiota tähän aiheeseen, antaa siitä käytävälle keskustelulle melkeinpä vapauttavan turhanpäiväisyyden ilmapiirin, sillä sekä kokelaat että kirjoittaja ovat miellyttävästi tietoisia siitä, että kumpikin tuhlaa toistensa aikaa. Sen sijaan, että tutkittavat omaksuisivat kovaa tiedettä ja painaisivat mieleen tenttikelpoisia tosiasioita, he voivat helposti lukea tätä puhtaasti mediaviihdyttävistä syistä tai hypätä eteenpäin aiheisiin, joista saa enemmän pisteitä.
Yhteenvetona:
- Solunesteen sisällöllä on joitain rakenteellisia erityispiirteitä:
- Pieni tilavuus, keskimäärin noin 2 pikolitraa.
- Täytteinen, täynnä proteiineja (20-30 painoprosenttia proteiineja).
- Valtaosa vedestä on adsorboituneessa muodossa.
- Tällä on erityisiä toiminnallisia ja kemiallisia etuja:
- Pienempi tila tarkoittaa suurta mahdollisuutta molekyylien vuorovaikutuksille.
- Makromolekyylien ”ahtaus” proteiineissa lisää niiden lämpöstabiilisuutta, lisää niiden vuorovaikutusten affiniteettia ja edistää itsejärjestäytymistä.
- Adsorboituneella vedellä on epätyypillisiä liuotinominaisuuksia, jotka ovat välttämättömiä entsyymien normaalille toiminnalle.
- Solunsisäisellä nesteellä on erikoinen kemiallinen koostumus ja ominaisuudet:
- Solunsisäisen nesteen ionit ovat adsorboituneet makromolekyyleihin ja niillä on vähentynyt diffuusioliikkuvuus (ehkä 15 % siitä, mitä voisi odottaa vapaasta liuoksesta)
- Ionien konsentraatiot tietyssä solussa vaihtelevat varsin dramaattisesti (+/- 20 mmol) solun ja sen aineenvaihdunnan terveydentilan mukaan. Karkeasti ottaen:
- Na+ 10-30 mmol/L
- K+ 130-150 mmol/L
- Mg2+ 10-20 mmol/L
- Ca2+ lähellä 0 mmol/L
- Cl- 10-20 mmol/L
- PO4-100-130 mmol/L
- Proteiinien anioninen varaus vaikuttaa osaltaan sähköneutraaliuteen
- PH soluissa vaihtelee välillä 6.0-7.5 ja vaihtelee alueellisesti sytosolissa
- Vaikka se koostuu 20-30 % proteiineista, sytosolilla on veden viskositeetti.
Mitkä ovat kelvollisia vertaisarvioituja lähteitä tähän aiheeseen? Valitettavasti niitä on lukuisia. Kun käyttää hakukonetta tai oppikirjan hakemisto-osiota etsiäkseen sanaa ”intrasellulaarinen neste”, sieltä löytyy väistämättä vastaus, sarja merkintöjä tai sivuja tai powerpoint-dioja, jotka – vaikka kaikki ovatkin sisällöltään hämärästi samankaltaisia – eroavat toisistaan lainattujen arvojensa osalta eivätkä tarjoa mitään viitteitä. Monet niistä eivät tarjoa lainkaan hyödyllistä tietoa. Kun esimerkiksi käännytään tätä aihetta käsittelevien virallisten yliopistokirjojen puoleen (Ganong, 23. painos, s. 2, ja Guyton & Hall, 13. painos, s. 4), havaitaan, että sytosolisten elektrolyyttien konsentraatioista puhutaan käyttämällä termejä kuten ”suuria määriä”. Jopa virallisen kirjallisuusluettelon ulkopuolella, muuten vankassa tarjonnassa, kuten Molecular Biology of the Cell, ei ole suoria vastauksia. He eivät edes pääse yksimielisyyteen siitä, miksi sitä pitäisi kutsua (sytosoli? Protoplasma? Primordialschlauch?)
Onneksi on vielä tiedemiehiä, jotka julkaisevat tästä aiheesta. Luultavasti paras artikkeli on Katherine Luby-Phelpsin vuonna 1999 kirjoittama artikkeli, joka sisältää periaatteessa kaiken, mitä voitte tarvita vastataksenne kaikkiin hypoteettisiin tuleviin SAQ-kysymyksiin tästä aiheesta. Toinen erinomainen artikkeli, joka käsittelee pääasiassa solunsisäisen materiaalin ominaisuuksia, on Richard P. Searin lyhyt artikkeli (2005). Jos joku on todella hullu ja hänellä on vakituisesti palkatun asiantuntijan aikaresurssit (eli hänellä ei ole kiireellistä velvollisuutta tehdä mitään hyödyllistä työtä), hän voi sen sijaan tutustua Gilbert Lingin teokseen In Search of the Physical Basis of Life (1984), 800-sivuiseen kirjaan, jonka on kirjoittanut mies, jonka julkaisut solufysiologian alalta ulottuvat 1950-luvulle asti.
Solunsisäisen tilan tilavuus
Minkä kokoinen on solu? Ilmeisesti se riippuu solusta. Hyvä esimerkki poikkeavasta solusta on Xenopuksen munasolu, afrikkalaisen kynsikonnan muna, jonka halkaisija on 1 mm. Ihmisistä puhuttaessa viitataan yleensä solunsisäiseen nesteeseen ikään kuin se olisi suhteellisen homogeeninen ämpäri, mutta itse asiassa tuo nestelokero koostuu noin 1014:stä pienestä lokerosta, joista jokainen on tilavuudeltaan ja koostumukseltaan hiukan erilainen.
Kaikkien näiden tilavuuksien heterogeenisuudesta on hyvä yhteenveto BioNumbers-tietokannan tässä luvussa, jossa on kaikenlaista pikkutarkasti referoitua tietoa. Se toistetaan tässä minimaalisilla muutoksilla siltä varalta, että Harvardin palvelimet joskus kaatuvat.
| Solutyyppi | Tilavuus (μm3, tai femtolitraa) | Tilavuus (pikolitraa) | Viite |
| Spermasolu | 30 | 0.03 | Gilmore et al, 1995 |
| Eryytrosyytti | 100 | 0.1 | Ballas et al, 1987 |
| Lymfosyytti | 130 | 0.13 | Schmid-Schonbein et al, 1980 |
| Neutrofiili | 300 | 0.3 | Rosengren et al, 1994 |
| Pancreatic β-cell | 1,000 | 1.0 | Finegood et al, 1995 |
| Enterosyytti | 1,400 | 1.4 | Wiśniewski et al, 2012 |
| Fibroblasti | 2,000 | 2.0 | Mitsui et al, 1976 |
| Kohdunkaulan kasvain (HeLa) | 3,000 | 3.0 | Zhao et al, 2008 |
| Karvasolu (korva) | 4,000 | 4.0 | Géléoc et al, 1999 |
| Osteoblasti | 4,000 | 4.0 | Beck et al, 2011 |
| Alveolaarinen makrofagi | 5,000 | 5.0 | Krombach et al, 1997 |
| Kardiomyosyytti | 15,000 | 15.0 | Calvillo et al, 2003 |
| Megakaryosyytti | 30,000 | 30.0 | Harker et al, 2000 |
| Adiposyytti | 60,000 | 60.0 | Livingston et al, 1984 |
| Oosyytti | 4.000.000 | 4000 | Goyanes et al, 1990 |
Se on siis melko laaja alue. Lisäksi ”solunsisäinen neste” ei selvästikään vie kaikkea solun sisältöä, riippumatta siitä, miten sinä määrittelet tuon termin. Esimerkiksi tässä luvussa solunsisäisen nesteen määritelmä on ”solunsisäinen sisältö, joka ei ole organelleja”, pelkästään siksi, että organelleja käsitellään toisessa luvussa. Tässä tapauksessa puhumme ”harmaasta, viskoosista, limaisesta, puoliksi läpikuultavasta ja puoliksi nestemäisestä aineesta”, joka täyttää solunsisäisen tilan muiden rakenteiden välissä (Harvey, 1937).
Riippuen siitä, minkälaista solua tarkastellaan, tuo tila voi olla hyvin pieni osa kokonaistilavuudesta. Esimerkiksi edellä mainitussa omentaalisessa adiposyytissä noista 60 pikolitrasta kokonaistilavuutta valtaosan vie vedetön rasva. Tämä voidaan osoittaa kokeellisesti: DiGirolamo & Owens (1976) pystyi laskemaan, että rotan adiposyyttien vesitilavuus oli noin 5-7 % kokonaistilavuudesta eli 1,5-2 pikolitraa.
Lyhyesti sanottuna kyseessä on hyvin pieni tilavuus. Miksi sillä on merkitystä? No. Solun sisäisen nesteen 1-2 pikolitran nestetilavuus on liukoisten aineiden jakautumistilavuus. Näiden aineiden molekyyleillä on siis hyvin lyhyt matka kuljettavana ennen kuin ne kohtaavat toisensa. Tämä lisää reaktionopeutta, mikä on hyödyllistä, koska reagenssimolekyylien kokonaismäärä näin pienessä tilavuudessa on väistämättä pieni. Luby-Phelpsin (2000) esimerkkiä lainatakseni, jos solun kokonaispitoisuus on 1 nanomooli proteiinia, se tarkoittaa, että solussa on vain 1000 kopiota kyseistä proteiinia. Onneksi näin pienen tilavuuden ollessa kyseessä sitoutuva molekyyli, jonka affiniteetti on vähäinenkin, pystyy pyyhkimään ja adsorboimaan suurimman osan käytettävissä olevasta substraatista.
Solunsisäisen nesteen proteiinipitoisuus
Okei, tilavuus on siis pieni. Mitä makromolekyylejä siinä on ja kuinka paljon? Alice B. Fulton (1982) punnitsi tätä kysymystä luultavasti selkeimmällä vastauksella julkaistussa kirjallisuudessa. Periaatteessa solujen proteiinipitoisuus on 17-35 painoprosenttia, ja useimmat kirjoittajat päätyvät arvioon 20-30 g/100 ml. Fulton siteeraa antiikin tekstejä (Loewy et al, 1969) antaakseen seuraavat arvot:
- Lihassolut: 23 painoprosenttia proteiinia
- Erythrosyytit: 35 % proteiinia painosta
- Useimmat muut solut: 17-26 % proteiinia painosta
Mittaukset tehdään yleensä taitekerroinmittauksin, mikä on tekniikka, joka ei yleensä erota toisistaan rakenteellisia proteiineja (esim. niitä, joista sytoskeletti ja organellit koostuvat) ja liukoisia proteiineja, jotka muodostavat loput mönjästä.
Mitä järkeä tässä keskustelussa on? No. Tämä proteiinipitoisuus on melko korkea. Se on suurempi kuin yleensä hyväksytty suurten polymeerien pitoisuus, jonka voisi olettaa vaikuttavan muiden samankaltaisten polymeerien diffuusioon, eli metsä on liian tiheä. Chang et al. (1987) laativat matemaattisen mallin, joka ennustaa, että 50 kDa:n ja sitä suurempien polymeerien diffuusioraja on noin 130 g/l, eli tätä suurempi määrä muita polymeerejä ei pääse diffundoitumaan helposti liuoksen läpi. Toki he käyttivät bentseeniin liuotettua polystyreeniä, mutta tosiasia on edelleen tosiasia. Vertailun vuoksi mainittakoon, että kun proteiini kiteytetään täysin, saadaan ”kiinteä aine”, joka sisältää vain 40 painoprosenttia proteiinia
Yhteenvetona voidaan todeta, että solunsisäisessä nesteessä olevat proteiinit ovat pakkautuneet niin tiiviisti yhteen, että sytosolia on kuvailtava ”ahtaaksi liuokseksi”. Tässä oleva sarjakuvamainen kaavio (jonka Goodsell julkaisi alunperin vuonna 1993 ja jota sittemmin käytännössä kaikki sytosolista kirjoittaneet ovat toistaneet) havainnollistaa visuaalisesti, kuinka tiiviisti nuo elimet ovat pakkautuneet. Piirros on approksimoitu käyttäen tunnettuja molekyylien kokoja ja muotoja/elektonimikroskooppia, mutta SEM:n kautta otetut kuvat (esim. Bridgman & Reese, 1984) osoittavat, että se kuvaa oikein sytosolin sotkuista mikrorakennetta. Kun tarkastellaan Xenopusin munasoluja ~ 80 000 suurennoksella, tulee näkyviin tiheä filamenttien ja rakeiden metsä. Tässä olevaa kuvaa (osa heidän kuvastaan 6) on itse asiassa puhdistettu hieman solujen lyysauksella ja pesuainepesulla, jotta saatiin poistettua osa proteiinikuormasta, joka muutoin peitti hienomman rakenteen. Nuolet osoittavat filamenttien Y- ja T-liitoksiin.
Ilman detergenttivalmistetta kaikki näiden filamenttien väliin pakkautunut hienojakoinen rakeinen aines tulee näkyviin. Kuva muistuttaa nyt valkoista kohinaa (samat kirjoittajat).
On selvää, että diffuusio tämän tiheikön läpi ei tule olemaan normaalia. Pienemmät liuenneet aineet (esim. natrium- ja kaliumionisi) joutuvat kiertämään nämä valtavat esteet ja kulkemaan maisemareittiä toisiaan kohti. Käytännön kannalta tämän pitäisi tarkoittaa, että kaikki reaktiot, jotka riippuvat diffuusionopeudesta, ovat hitaampia. Jos molekyyleillä kestää ikuisuuden tavoittaa toisensa, niiden vuorovaikutuksen nettonopeuden pitäisi varmasti pienentyä. Näin ei kuitenkaan tapahdu.
Mitä kemiallisia ominaisuuksia näemme tässä erittäin kylläisessä proteiinipitoisessa keitossa? Allen P. Minton (2006) on tehnyt yhteenvedon vuosien (lähinnä omasta) tutkimustyöstään edellä viitatun artikkelin taulukossa. Se on tiivistettynä tässä:
- Muuten laimeiden makromolekyylien lisääntynyt sitoutumisaffiniteetti toisiinsa
- Proteiinien assosiaatioiden nopeutuminen esim. itsejärjestäytyminen
- Diffuusiorajoitteisten reaktioiden ja proteiiniassosiaatioiden hidastuminen
- Proteiinien stabiloituminen lämpödenaturaatiota vastaan
Yhteenvetona voidaan todeta, että ahtaus pakottaa proteiinit taittumaan ja vuorovaikutteisuuteen, jolloin syntyy kompleksisia konfiguraatioita, jotka olisivat muutoin mahdottomia laimeassa liuoksessa. Esimerkiksi Wilf & Minton havaitsi vuonna 1981, että laimennetut myoglobiinimolekyylit liuoksessa eivät juurikaan kiinnosta toisiaan, mutta 10 %:n liuoksen lisääminen (mitä tahansa!) muuta proteiinia saa myoglobiinin spontaanisti kasaantumaan dimeereiksi.
Solunsisäisen veden ominaisuudet
Jopa kiteytyneessä proteiinissa vain 40 % massasta on varsinaista proteiinia. Loppuosa on liuotinta, joka täyttää pakattujen proteiinimolekyylien väliset tilat (ne eivät ole aivan suorakulmioita, eivätkä pinoudu siististi). Kun liuotin on vettä, puolet siitä päätyy adsorboituneena proteiinin pintaan, mutta loput voidaan edelleen pitää tavallisena nestemäisenä vetenä. Tähän ohueen kalvoon solunsisäisen veden ionit ovat liuenneet.
Sitoutuneen adsorboituneen veden kanssa asiat ovat selvästi hieman toisin. Esimerkiksi tämän veden liuotinominaisuudet eivät tule olemaan täsmälleen samat kuin ”vapaan” veden. Ensinnäkin sen kemiallinen aktiivisuus todennäköisesti vähenee. Kuten arvata saattaa, veden ”järjestetty” tila antaa sille useita epätavallisia kolligatiivisia ominaisuuksia – esimerkiksi Foster et al. (1976) havaitsivat, että sen jäätymispiste on alentunut. Lisäksi sytosolissa tulee olemaan taskuja, joissa aktiivisuus on lisääntynyt (hydrofiilisten proteiinirakenteiden ympärillä) ja vähentynyt (hydrofobisten rakenteiden ympärillä).
Minkä osan vedestä proteiinit pitävät tässä vangittuna? Sitä on jokseenkin vaikea sanoa. Ling et al. (1993) tekemät kokeet viittaavat siihen, että solujen sisällä suurin osa vedestä on ”järjestäytynyt” tällä tavoin, mutta useimpiin tästä aiheesta raportoiviin kokeisiin vaikuttaa jonkin verran se, että niiden käyttämillä raaoilla elävillä soluilla on erilaisia homeostaattisia reaktioita koeolosuhteisiin, jotka sekoittavat havainnot.
Yleisesti tätä vastausta yritetään saada selville soluja osmoottisesti kuivattamalla. Sovelletaan osmoottista painetta, he päättelevät, ja kaiken ”liikkuvan” veden pitäisi tulla ulos solusta. Sitten mitataan solun vesipitoisuus, ja kaiken jäljelle jääneen täytyy olla ”liikkumatonta”, proteiinimolekyylien pinnalle pysäköityä, eikä se pysty siirtymään osmoottisen paineen vaikutuksesta. Cameron ja muut (1997) esittävät kuvaajan (joka on varastettu häpeilemättä ja esitetty tässä vasemmalla), jossa jäljellä olevien solujen vesipitoisuus on piirretty kasvavan osmoottisen paineen x-akselia vasten. Kun paineen ja jäljellä olevan veden välinen viiva ekstrapoloitiin kokeellisten todisteiden perusteella ja sitä jatkettiin kohti ”ääretöntä” osmoottista painetta, y-akseli risteää jossakin nollasta poikkeavassa pisteessä. Riippuen siitä, mitä soluja käytit, se päätyi jonnekin 30-90 %:n välille kokonaisvesipitoisuudesta.
Itse asiassa näyttää siltä, että tämä proteiineihin adsorboitunut vesi on solujen välttämätön vesi, ja kaikki ”vapaa” vesi on turhaa painolastia. Clegg (1981), joka rehydratoi joitakin kuivattuja suolakatkarapusoluja, havaitsi, että metabolinen aktiivisuus jatkui ja oli suhteellisen normaalia, kun soluihin palautettiin noin 35 painoprosenttia vettä. eli suunnilleen niin paljon kuin odotetaan kaikkien makromolekyylien ”hydratoimiseksi”. Näissä katkaravuissa ei lähes varmasti ollut lainkaan ”irtovaiheen” vapaata vettä. Katkaravut eivät toki yrittäneet lisääntyä tai syntetisoida RNA:ta (se vaati 70-80 %:n nesteytystä), mutta niiden aminohappojen synteesi ja kaasujen vaihto sujuivat suhteellisen normaalisti. Sitäkin ihmeellisemmäksi tekee se, että objektiivisesti mitattuna tämän paksun 20-30-prosenttisen proteiinikeiton viskositeetti muistuttaa läheisesti normaalia vettä (Luby-Phelps, 1994)
Solunesteen pH
Carter (1972) julkaisi tästä erittäin vaikutusvaltaisen artikkelin, jota siteerataan usein ihmisen fysiologian oppikirjoissa, vaikka kirjoittaja käytti jättiläislampikorennon (Balanus nubilus) lihaksia, jotka hän suspendoi niin sanottuun ”barnacle Ringer’s solution” -liuokseen, joka on suolaliuos, jossa on 450 mmol/l natriumia ja 518 mmol/l kloridia. Tällaisia tietoja tuskin voi lukea eteenpäin kunnioittaen niiden yleistettävyyttä ihmiselle, mutta jos näin tekee, havaitsee tärkeimmän havainnon: solujen pH-arvo on lokeroitunut niin paljon, että sytosolin eri alueiden pH-arvot vaihtelevat rajusti 6,0 ja 7,5 välillä.
Solunsisäiset elektrolyyttikonsentraatiot
Kysyttäessä solunsisäisen nesteen elektrolyyttikonsentraatioita kaikki oppikirjat tuottavat yleensä tämänkaltaisen Gamblegrammin (väärennetty lähteestä Ling, 1984, ilman hänen kuolinpesänsä tai kustantajansa lupaa).
Tähän kaavioon ei viitata Lingin kirjassa, mutta voisi väittää, ettei sen tarvitsekaan olla, kun otetaan huomioon, että Ling teki käytännössä kaiken uraauurtavan työn solunsisäisten liuottimien käyttäytymisen määrittämiseksi. Erityisesti hän ja Ochsenfeld totesivat 1960-luvulla, että kalium (ja kaikki muutkin sytosolin elektrolyytit) eivät yleensä ole vapaasti käytettävissä, vaan ne ovat adsorboituneet makromolekyylirakenteisiin.
Tutkijat haastoivat soluja radioleimatuilla isotoopeilla ja havaitsivat, että tämä ei juurikaan syrjäyttänyt siellä jo esiintyviä elektrolyyttejä, mitä olisi odotettu, jos ne olisivat olleet vapaasti jakautuneita. Solunsisäiset elektrolyytit ovat suurelta osin makromolekyylien kanssa muodostuneina komplekseina, ja ne ovat paljon vähemmän liikkuvia kuin voisi olettaa solumallissa, jossa kaikki solun sisältö on homogeenisessa vesipussissa. Samat kirjoittajat (Ling & Ochsenfeld, 1973) vahvistivat myöhemmin, että kaliumin liikkuvuus solunsisäisestä lokerosta solunulkoiseen lokeroon oli noin kahdeksasosa siitä, mitä voitaisiin odottaa yksinkertaisen diffuusion perusteella vapaassa liuoksessa. Kuollut sammakonlihas vuoti kaliumia jonkin verran helpommin (diffuusionopeus pieneni vain 25 % odotetusta), koska ATP:n avulla toimivat pumput lakkasivat toimimasta ja proteiinirakenne muuttui epäjärjestyneeksi.
Sopi siis, että nämä ionit eivät ole liuenneet vapaan solunsisäisen veden räiskyvään järveen vaan pikemminkin sitoutuneet komplekseihin. Se ei silti vastaa kysymykseen: kuinka paljon mitä siellä on? Kävi ilmi, että siihen on suhteellisen helppo vastata. Se on itse asiassa paljon helpompaa kuin mikään muu tässä luvussa tähän mennessä esitetty kysymys. Täytyy vain ottaa sytosoli, pakastekuivata se ja mitata sitten kuivamassan alkuainekoostumus. Mason et al. (1981) tekivät juuri näin joillekin munuaistubulussoluille ennen ja jälkeen iskemiaa. Heidän tuloksensa esitetään jäljempänä sekä alkuperäisenä vuoden 1981 taulukkona että hienona kiiltävänä Gamblegrammina:
Kuten kaliumkonsentraation hurjista vaihteluista voidaan nähdä jopa 20 minuutin sepelvaltimotaudin jälkeen, solujen elektrolyyttikoostumus on paljon nestemäisempi kuin solunulkoisen nesteen koostumus (jossa minkä tahansa elektrolyytin konsentraation 20 mmol:n suuruinen muutos sietäisi huonosti elimistön eloonjäämisen tasolla). Tämän lisäksi jokaisella solulinjalla on hieman erilainen solunsisäinen ionipitoisuus. Tästä johtuu oppikirjoissa käsiteltyjen solunsisäisten elektrolyyttiarvojen epätarkkuus ja yleinen haluttomuus mainita mitään lukuja. Käytännöllisesti katsoen mikä tahansa mainittu luku on väärä. Esimerkiksi Masonin distaalisten tubulusten sytosolissa oli 11mmol/L natriumia, mutta Poole-Wilson (1975) löysi vasemman kammion myosyytteistä noin 44mmol/L ja vasemmasta nelipäisestä lihaksesta 20mmol/L. Alam et al. (1977) antoivat natriumin arvoksi noin 25 mmol/l ja kaliumin arvoksi 145 mmol/l joissakin vajaatoiminnassa olevissa maksasoluissa. Lyhyesti sanottuna, minkä tahansa solun sotkuinen ja arvaamaton ympäristö tekee tiettyjen lukujen ilmoittamisen vaikeaksi.