Materiaalit ja menetelmät
Osallistujat
Koehenkilöt olivat 83 lasta, joilla oli ADHD-oireyhtymä (75 % miehiä), ja 72 TD-lasta (51 % miehiä), jotka olivat iältään 6-13-vuotiaita. ADHD-ryhmän sisäänottokriteerit olivat: (a) kliininen ADHD-diagnoosi DSM-IV-kriteerien mukaisesti, (b) tämän diagnoosin vahvistaminen vanhemmille annetulla Diagnostic Interview Schedule for Children, neljäs painos (DISC-IV-P); ), (c) merkittävät ADHD-oireet, jotka ilmenivät vanhempien arvioinneista >90. prosenttiyksikkö vähintään yhdellä ADHD-asteikolla (tarkkaamattomuus- ja ylivilkkaus-/impulsiivisuusasteikot) Disruptive Behaviour Disorder Rating Scale -asteikossa (DBDRS; ), ja (d) pervasive ADHD-oireet, jotka ilmenivät opettajien arvioinneista >75. prosenttiyksikkö vähintään yhdellä DBDRS:n ADHD-asteikolla. Liitännäisdiagnoosi (esimerkiksi ODD tai ASD) ei ollut poissulkukriteeri, kuten ei myöskään stimuloiva lääkehoito. Stimulanttilääkitystä käyttävät lapset (N = 50, 60 % ADHD-ryhmästä) lopettivat lääkkeiden käytön 24 tuntia ennen testausta, jotta täydellinen huuhtoutuminen olisi mahdollista, ja tutkimukseen osallistumisen aikana. TD-ryhmän sisäänottokriteerit olivat seuraavat: (a) kliinisen diagnoosin puuttuminen mistään kehitys- tai käyttäytymishäiriöstä (mukaan lukien ADHD ja ODD), ja (b) pisteet <90. persentiili sekä DBDRS:n vanhempien että opettajien arvioimilla ADHD-asteikoilla.
Aineisto
Käyttäytyminen.
DADHD-ryhmään hyväksyttävien lasten vanhemmat arvioitiin DISC-IV-P:n häiritsevän käyttäytymishäiriön osiolla. DISC-IV-P on laajalti käytetty standardoitu diagnostinen haastattelu DSM-IV:n mukaisten lapsuuden psykiatristen häiriöiden arviointiin, ja sillä on riittävät psykometriset ominaisuudet.
Sekä ADHD- että TD-ryhmään kuuluvien lasten vanhemmat ja opettajat täyttivät DBDRS-mittarin, jolla arvioitiin ADHD-oireita sekä häiriökäyttäytymishäiriön (ODD) ja CD:n oireita. DBDRS sisältää neljä asteikkoa, joilla mitataan tarkkaamattomuuden, hyperaktiivisuuden/impulsiivisuuden, ODD:n ja CD:n oireita neliportaisella Likertin asteikolla (vaihteluväli 0:sta 3:een), ja korkeammat pistemäärät merkitsevät huonompia oireita. DBDRS:n psykometristen ominaisuuksien on raportoitu olevan riittävät.
Vanhemmat ja opettajat täyttivät ADHD-oireiden ja normaalin käyttäytymisen arviointiasteikon (Strengths and Weaknesses of ADHD-symptoms and Normal Behaviour rating scale, SWAN; ) ADHD-oireiden arvioimiseksi. Tämä laajalti käytetty kyselylomake sisältää kaksi osa-asteikkoa; tarkkaamattomuusasteikko ja hyperaktiivisuus/impulsiivisuusasteikko, joista kumpikin koostuu 9 kohdasta. Kohdat pisteytetään 7-pisteisellä Likertin asteikolla (vaihteluväli -3:sta +3:een), ja korkeammat pisteet merkitsevät oireiden pahenemista. Kysymykset perustuvat DSM-IV:n ADHD-oireisiin, mutta ne heijastavat kunkin ADHD-oireen kuvaaman käyttäytymisen molempia ääripäitä (vahvaa ja heikkoa). Riippuvina muuttujina käytettiin molempien osa-asteikkojen keskiarvoja. SWANin psykometristen ominaisuuksien on raportoitu olevan riittävät.
ASD-oireita arvioitiin vanhempien ja opettajien täyttämällä 65-kohtaisella Social Responsiveness Scale (SRS; ) -asteikolla. SRS:n kohdat perustuvat DSM-IV:n ASD:n oirealueisiin, mukaan lukien sosiaalisen vuorovaikutuksen heikentyminen, kommunikatiiviset puutteet ja rajoitetut / stereotyyppiset käyttäytymismallit tai kiinnostuksen kohteet. SRS:ssä käytetään neliportaista Likertin asteikkoa (0-3), ja riippuvaisena mittarina käytettiin SRS:n kokonaispistemäärän yhteenlaskettua pistemäärää, jossa korkeammat pistemäärät merkitsevät huonompia oireita. SRS:llä on riittävät psykometriset ominaisuudet.
Veripisteet.
Tryptofaanin, tyrosiinin ja fenyylialaniinin pitoisuuksien tutkimiseksi veressä käytettiin kuivattua veripistetekniikkaa. Veripilkkujen kerääminen on lapsille vähemmän invasiivista kuin laskimoverinäytteiden ottaminen, ja kuivattujen veripilkkujen tekniikka on riittävän vankka ja vakaa diagnostisiin tarkoituksiin. Veripisteiden AAA-pitoisuudet korreloivat hyvin seerumin AAA-pitoisuuksien kanssa (rs vaihtelee 0,86:sta 0,96:een). Jokaiselta lapselta otettiin verinäyte kertakäyttöisellä turvalansetilla. Kolme veripisaraa tiputettiin veritahrakorttiin. Kuivatusta veripisteestä otettu 5,5 mm:n reikä sekoitettiin 100μl:aan sisäistä standardiliuosta (joka sisälsi 29μM L-fenyylialaniini-D5:tä, 6μM L-tyrosiini-D4:tä ja 5μM L-tryptofaani-D5:tä) ja 400μl metanolia kaasukromatografiapullossa (GC-pullo), ja sitä ravisteltiin 15 minuutin ajan ultraäänihauteessa. Supernatantti siirrettiin toiseen GC-pulloon ja haihdutettiin typen alla 30 °C:ssa. Tämän jälkeen näyte butyloitiin 100μl:lla 5,5 % asetyylikloridia (n-butanolissa) 60 °C:ssa 15 minuutin ajan. Tämän jälkeen butanolikerros haihdutettiin typen alla (30 °C:ssa) ja jäännös liuotettiin 500 μl:aan asetonitriiliä. Tryptofaanin, tyrosiinin ja fenyylialaniinin pitoisuudet veripisteissä määritettiin positiivisella sähkösuihku-nestekromatografia-tandem-massaspektrometrillä (LC-MS/MS) käyttäen API 3000 -kolmiokvadrupoli-massaspektrometriaa (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), joka oli kytketty korkean suorituskyvyn nestekromatografiajärjestelmään (HPLC) (Perkin Elmer Series 200, Shelton, USA). Kolme μl näytettä ruiskutettiin symmetriseen C18-kolonniin (3,9*150mm, 5μm; Waters, Milford, MA, USA) ja eluoitiin virtausnopeudella 1 ml/min 75-prosenttista asetonitriiliä (joka sisälsi 0,4 % muurahaishappoa). Tryptofaani, tyrosiini ja fenyylialaniini eluoituivat 1 minuutin kuluessa, ja ne mitattiin käyttämällä siirtymiä: massa-lataussuhde (m/z) 261,2→159,2 (tryptofaani), m/z 238,2→136,2 (tyrosiini) ja m/z 222,2→120,2 (fenyylialaniini). Kaikki saadut LC-MS/MS-tiedot hankittiin ja käsiteltiin Analyst 1.4.2 -ohjelmistolla (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Tryptofaanin, tyrosiinin ja fenyylialaniinin pitoisuudet veripisteissä ilmaistiin μmol/l. LC-MS/MS:n luotettavuus varmistettiin tarkastelemalla tutkimusten välistä varianssia (5-10 %), tutkimusten sisäistä varianssia (8-10 %) ja saantoa (90-112 %).
Proteiinin saanti ravinnosta.
Päivittäinen proteiinin saanti arvioitiin kolmen päivän aikana vanhempien ilmoittaman ravitsemuspäiväkirjan avulla. Standardoidut ruokavaliomerkinnät ja -ohjeet annettiin. Vanhempia ohjeistettiin kirjaamaan kaikki nautitut ruoat ja juomat ruokapäiväkirjaan ja ilmaisemaan nautitut määrät mahdollisimman tarkasti. Proteiinin saannin määrä (grammaa/vrk) laskettiin Alankomaiden elintarvikkeiden koostumustietokannan tietokonepohjaisen version perusteella. Alankomaiden elintarvikekoostumustietokanta sisältää yli 2000 elintarviketuotetta, joiden ravintoainekoostumuksesta on tietoa . Tietokantaa käytetään laajalti tieteellisiin tarkoituksiin (esim.).
Virtsa.
Virtsan AAA-pitoisuuksien tutkimiseksi osallistujat keräsivät virtsankeräysastiaan kaiken virtsan, joka erittyi 18 peräkkäisen tunnin aikana (koulupäivän jälkeen). Virtsankeräysastia säilytettiin virtsankeräyksen aikana jääkaapissa (<5 °C). 10 ml:n näyte lähetettiin laboratorioon analysoitavaksi, jossa näyte säilytettiin -20 °C:ssa. Virtsan tryptofaanin analysointiin käytettiin HPLC-tekniikkaa, jossa on fluoresenssidetektori. Tyrosiinin ja fenyylialaniinin pitoisuudet virtsassa määritettiin Biochrom-aminohappoanalysaattorilla . Tryptofaanin, tyrosiinin ja fenyylialaniinin pitoisuudet virtsassa ilmaistiin μmoolin ja virtsan kokonaistilavuuden suhteena, jotta polyurian tai oligurian vaikutukset voitiin sulkea pois. HPLC-tekniikan luotettavuus vahvistettiin tarkastelemalla analyysien tarkkuutta, joka oli tryptofaanin osalta 2,25 % (suhteellinen keskihajonta) ja tyrosiinin ja fenyylialaniinin osalta 1,50 %. 12 tunnin näytteiden ja 24 tunnin näytteiden aminohappopitoisuuksien välillä on korkea korrelaatio, mikä osoittaa, että aminohappojen erittymisessä ei ole vuorokausivaihtelua, mikä puoltaa 18 tunnin näytteen käyttöä tässä tutkimuksessa.
Menettely
Tälle tutkimukselle on saatu hyväksyntä Amsterdamin VU-yliopiston lääketieteellisen keskuksen (VU University Medical Center Amsterdam, Alankomaat) paikalliselta lääketieteelliseltä eettiseltä toimikunnalta (#NL39922.029.12), ja se on suoritettu vuonna 1964 annetussa Helsingin julistuksessa ja sen myöhemmissä muutoksissa vahvistettujen eettisten standardien mukaisesti. Kaikkien lasten vanhemmilta ja ≥ 12-vuotiailta lapsilta saatiin kirjallinen tietoinen suostumus ennen osallistumista. ADHD:tä sairastavat lapset rekrytoitiin mielenterveyspoliklinikoilta, käyttäytymisongelmaisten lasten vanhempainyhdistyksen kautta ja yliopiston tutkimussivuston kautta. TD-ryhmä rekrytoitiin eri puolilla maata sijaitsevista peruskouluista. Stimulanttilääkitystä käyttävät lapset lopettivat lääkkeiden käytön päivää ennen osallistumista (päivä 0), jotta varmistettiin täydellinen huuhtoutuminen, sekä veren, virtsan ja ruoan saannin arvioinnin aikana (päivä 1 – 3). Päivänä 1 verinäyte otettiin varhain aamulla, jotta voitiin sulkea pois veren AAA-pitoisuuksien vuorokausivaihtelun vaikutukset. Samana päivänä, kouluajan jälkeen, virtsan keräys aloitettiin ja sitä jatkettiin seuraavien 18 tunnin ajan, kunnes lapsi palasi kouluun seuraavana aamuna (päivä 2). Päivän 1 varhain aamulla vanhemmat saivat yksityiskohtaiset ohjeet siitä, miten ruokavaliokirja täytetään ja miten lapsen virtsa kerätään. Ohjeistuksen jälkeen vanhemmat aloittivat lapsensa ravinnonsaannin kirjaamisen, jota jatkettiin seuraavien kolmen päivän ajan (päivä 1 päivästä 3 päivään). Vanhempia ja opettajia pyydettiin täyttämään kyselylomakkeet suojatulla verkkosivustolla. Kaikki tiedot kerättiin helmikuun 2013 ja heinäkuun 2014 välisenä aikana. ADHD- ja TD-ryhmä rekrytoitiin samanaikaisesti, jotta voitiin kontrolloida mahdollisia vuodenaikojen vaikutuksia ruoan saantiin tai AAA-aineenvaihduntaan.
Aineiston analyysi
Kaikki tilastolliset analyysit tehtiin käyttäen R-ohjelmaa, versio 3.2.1. Kaikki muuttujat tarkastettiin poikkeavien ja puuttuvien arvojen osalta ADHD- ja TD-ryhmässä erikseen. Poikkeaviin arvoihin sovellettiin Winsorising-menetelmää, ja ne korvattiin yksikköä suuremmalla (tai pienemmällä) arvolla kuin ryhmän jakauman edellinen äärimmäisin pistemäärä. Puuttuvat tiedot virtsapitoisuuksissa, ravitsemustiedoissa ja käyttäytymistiedoissa jaettiin satunnaisesti ja korvattiin käyttämällä ryhmän keskiarvoja. Veripisteiden osalta ei ollut puuttuvia tietoja. Kaikki tiedot jakautuivat normaalisti CD-oireita lukuun ottamatta. Ryhmäeroja sukupuolen suhteen tutkittiin khiin neliö -testillä, ja ryhmäeroja iän ja käyttäytymisen toimintakyvyn suhteen tutkittiin riippumattomien otosten t-testeillä.
Ensimmäisen hypoteesin testaamiseksi AAA-veripistepitoisuuksien ryhmäeroja arvioitiin käyttäen varianssianalyysejä (ANOVA), joissa ryhmä (ADHD tai TD) oli kiinteä tekijä. Vaikutuskoot laskettiin osittaisena eta-neliönä, ja ne tulkittiin pieniksi (> .01), keskisuuriksi (>.06) tai suuriksi (>.14) . Lisäksi laskettiin odds-suhteet, jotka ilmaisivat riskin saada ADHD-diagnoosi keskimääräistä alhaisemmilla AAA-pitoisuuksilla. AAA-pitoisuuksia koskevat normatiiviset tiedot saatiin suuresta 6-13-vuotiaiden lasten näytteestä (N = 104, 52 % miehiä) (julkaisemattomat tiedot, näytetiedot ja tulokset saatavissa kirjoittajilta). Kunkin AAA:n osalta normatiivisen otoksen alinta 16. persentiiliä (M-1 SD) vastaavia pitoisuuksia käytettiin kynnysarvona keskimääräistä alhaisempien AAA-pitoisuuksien määrittelemiseksi (tryptofaanille 45 μmol/l, tyrosiinille 39 μmol/l ja fenyylialaniinille 47 μmol/l). Odds-suhteet laskettiin 95 prosentin luottamusväleineen, ja Fisherin eksaktilla testillä tutkittiin odds-suhteiden merkitsevyyttä.
Toisen hypoteesin testaamiseksi Pearsonin tuotosmomenttikorrelaatiokertoimilla tutkittiin veripisteen AAA-pitoisuuksien ja sekä vanhempien että opettajien arvioimien ADHD-oireiden välistä yhteyttä. Korrelaatiokertoimien suuruus tulkittiin pieneksi (>.10), keskisuureksi (>.30) tai suureksi (>.50) . ADHD-ryhmän ja TD-ryhmän tiedot yhdistettiin ADHD-oireiden mittausten vaihtelun maksimoimiseksi.
Kolmannen hypoteesin testaamiseksi suoritettiin korrelaatioanalyysit veripisteen AAA-pitoisuuksien ja proteiinin nauttimisen ja virtsan AAA-pitoisuuksien välillä koko näytteessä. Tutkittiin myös, oliko proteiinin nauttimisessa ja virtsan AAA-pitoisuuksissa ryhmäeroja käyttämällä ANOVA-analyysejä, joissa ryhmä (ADHD tai TD) oli kiinteä tekijä. Lopuksi korrelaatioanalyyseillä arvioitiin, oliko veripisteen AAA-pitoisuuksilla yhteyttä vanhempien ja opettajien ilmoittamiin psykiatristen häiriöiden liitännäisoireisiin (Pearsonin tuotosmomenttikorrelaatiokertoimet ODD:n ja ASD:n osalta, Spearmanin rank-korrelaatiokertoimet CD:n osalta). Jos ODD:n, CD:n tai ASD:n oireiden havaittiin olevan yhteydessä AAA-pitoisuuksiin, aiemmat analyysit suoritettiin uudelleen siten, että nämä oireet sisällytettiin muuttujiksi. Moninkertaisen testauksen korjaamiseksi korrelaatioanalyysien alfa-tasoa säädettiin Bonferroni-menettelyn mukaisesti tulosalueittain; ADHD-oireet (12 analyysia, joten p = .004), AAA-poikkeavuuksien mahdolliset määrittävät tekijät veripisteissä (12 analyysia, joten p = .004) ja liitännäispsykiatristen häiriöiden oireet (18 analyysia, joten p = .003). Bonferroni-korjatut tulokset ilmoitetaan.