Metyloituneen O6-metyyliguaniini-DNA-metyylitransferaasin (MGMT) kopioluku määritetään suhteessa beeta-aktiinin (ACTB) kopiolukuun reaaliaikaisella metylaatiospesifisellä polymeraasiketjureaktiolla (MSP). Tätä varten kasvainkudoksen sisältö rikastetaan manuaalisella mikrodissektiolla, jota seuraa DNA:n uuttaminen. DNA kvantifioidaan Picogreen-menetelmällä ja muunnetaan bisulfiittikäsittelyllä, joka saa aikaan sen, että metyloitumattomat sytosiinit muuttuvat urasyyliksi, kun taas metyloituneet sytosiinit pysyvät muuttumattomina. Tämän jälkeen suoritetaan reaaliaikainen metylaatiospesifinen PCR (Methylation Specific PCR, MSP) Quantstudio 5 -laitteella MGMT:n ja ACTB:n kopioluvun kvantifioimiseksi (1). Tämä tekniikka koostuu PCR:n suorittamisesta reaaliaikaisella detektiolla käyttäen amplifluoridetektiojärjestelmää. Näytteet, joiden kopioluku on tuntematon, voidaan kvantifioida vertaamalla niiden Ct-arvoja plasmidistandardikäyrän Ct-arvoihin.
Kliiniset vaikutukset
MGMT on DNA:n korjausentsyymi, joka usein deaktivoituu hypermetyloitumalla ihmisen syövässä. Kun soluista puuttuu MGMT:n aktiivisuus, DNA-vauriot eivät korjaannu kunnolla, jolloin yksilö on alttiimpi syövän kehittymiselle. Mielenkiintoista on, että MGMT:n aktiivisuuden puute tekee kasvainsolusta myös herkemmän sädehoidolle ja tietyille alkyloiville lääkkeille, kuten temotsolomidille (2). Kansainvälisessä vaiheen III (RTOG 0525) validointitutkimuksessa MGMT-määritys tunnisti menestyksekkäästi vasta diagnosoidut glioblastoomapotilaat, jotka elävät todennäköisemmin pidempään ja joilla on pidempi etenemisvapaa aika temotsolomidihoidon jälkeen (3-5). Äskettäin julkaistiin uusi julkaisu, jossa sekä metyloitujen että ”harmaalla vyöhykkeellä” elävien potilaiden kokonaiselossaoloaika oli huomattavasti parempi kuin todella metyloitumattomien potilaiden (6).
Näytevaatimukset
Määritykseen hyväksyttäviä näytteitä ovat formaliiniin kiinnitetyt, parafiiniin upotetut glioomakudosnäytteet, joiden kiinnitysaika on 6-48 tuntia.
Tilavuus
Ensimmäinen edustava parafiinilohko on suositeltava. Vaihtoehtoisesti hyväksytään 5 värjäämätöntä kudosleikettä (1 5 µm:n paksuinen preparaatti H&E-värjäystä varten ja vähintään 4 5-10 µm:n paksuista preparaattia MGMT-testausta varten).
Säilytys- ja lähetysohjeet
Säilytä ja lähetä näytteet huoneenlämmössä.
Rajoitukset
Joidenkin näytteiden osalta saadaan virheellinen tulos, koska ACTB-kopioiden määrä on riittämätön yhdessä MGMT-kopioiden määrän kanssa, joka on alle toteamisrajan. Useimmiten tämä selittyy riittämättömällä DNA:n määrällä ja/tai laadulla. Virheellisten näytteiden osalta, joissa MGMT:n ja/tai ACTB:n kopiomäärä on LOD/LOQ:n ja raja-arvon tuntumassa, suositellaan uusintatestin tekemistä bisulfiittikäsitellystä DNA:sta alkaen. Muut fiksatiivit kuin formaliini tai pitkittynyt fiksaatioaika voivat johtaa riittämättömiin tuloksiin.
Erityisvaatimukset
Ei ole
Kierrosaika
Viisi-seitsemän pankkipäivää objektilasien ja parafiinilohkojen osalta.
- Vlassenbroeck I et al. Validation of Real-Time Methylation-Specific PCR to determine O6-Methylguanine-DNA Methyltransferase Gene Promotor Methylation in Glioma. J Mol Diagn. 2008 Jul;10(4):332-7
- Hegi ME et al. MGMT-geenin silencing and benefit from temozolomide in glioblastoma. N Engl J Med 2005 Mar 10;352(10):997-1003.
- Gilbert MR et al. Dose-dense temozolomide for newly diagnosed glioblastoma: a randomized phase III clinical trial.(7). J Clin Oncol. 2013 Nov 10;31(32):4085-91.
- Malmström A et al. Temozolomide versus tavanomainen 6 viikon sädehoito versus hypofraktioitu sädehoito yli 60-vuotiailla potilailla, joilla on glioblastooma: pohjoismainen satunnaistettu, vaiheen 3 tutkimus. Lancet Oncol 2012 Sep; 13(9): 916-926.
- Wick W et al. Temozolomide chemotherapy alone versus radiotherapy alone for malignant astrocytoma in the elderly: the NOA-08 randomised, phase 3 trial. Lancet Oncol 2012 Jul; 13(7): 707-715.
- Hegi ME et al. MGMT Promoter Methylation Cutoff with Safety Margin for Selecting Glioblastoma Patients into Trials Omitting Temozolomide. A Pooled Analysis of Four Clinical Trials. Clin Cancer Res 2019 Mar 15; 25(6): 1809-1816.
Päivitetty 23.5.2019
.