1. Kuvaile DNA:n kaksoiskierteen kemialliset sidostyypit ja voimat.
DNA:n kaksoiskierteessä on kahdenlaisia sidoksia, kovalenttisia ja vetysidoksia. Kovalenttisia sidoksia on kunkin lineaarisen säikeen sisällä, ja ne sitovat vahvasti emäksiä, sokereita ja fosfaattiryhmiä (sekä kunkin komponentin sisällä että komponenttien välillä). Vetysidoksia on kahden säikeen välillä, ja ne muodostuvat toisen säikeen emäksen ja toisen säikeen emäksen välille komplementaarisessa pariliitoksessa. Nämä vetysidokset ovatyksilöllisesti heikkoja, mutta yhdessä melko vahvoja.
2. Selitä, mitä tarkoitetaan termeillä konservatiivinen ja semikonservatiivinen replikaatio.
3. Mitä tarkoitetaan alukkeella ja miksi alukkeet ovat välttämättömiä DNA:n replikaatiossa?
Alukkeella tarkoitetaan lyhyttä RNA:n pätkää, jonka alukkeena oleva primaasi syntetisoi DNA:n avulla DNA:ta templaattina DNA:n replikaation aikana. Alukkeen syntetisoinnin jälkeen DNA-polymeraasi lisää RNA:n 3′-päähän DNA:ta. Alukkeita tarvitaan, koska DNA:n replikaatiota katalysoiva pääasiallinen DNA-polymeraasi ei pysty aloittamaan DNA:n synteesiä, vaan se tarvitsee 3′-pään. Tämän jälkeen RNA poistetaan ja korvataan DNA:lla niin, että lopputuotteessa ei ole aukkoja.
4. Mitä ovat helikaasit ja topoisomeraasit?
5. Mitkä ovat helikaasit ja topoisomeraasit? Miksi DNA-synteesi on jatkuvaa toisella säikeellä ja epäjatkuvaa vastakkaisella säikeellä?
Koska DNA-polymeraasi kykenee lisäämään uusia nukleotideja vain DNA-säikeen 3′-päähän ja koska molemmat säikeet ovat antiparalleelisia, DNA-polymeraasin on osallistuttava vähintään kahden molekyylin DNA-polymeraasin replikaatioon jollakin tietyllä DNA-alueella. Kun alueesta tulee yksisäikeinen, molemmat säikeet ovat vastakkaissuuntaisia. Kuvitellaan yksijuosteinen alue, joka kulkee vasemmalta oikealle. Vasemmassa päässä yhden säikeen 3′-pää osoittaa oikealle, ja synteesi voi alkaa ja jatkua alueen oikeaan päähän. Toisen säikeen 5′-pää osoittaa oikealle, eikä synteesi voi käynnistyä ja jatkua yksisäikeisen alueen oikeaan päähän 5′-päässä. Sen sijaan synteesin on käynnistyttävä jostain yksisäikeisen alueen vasemman pään oikealta puolelta ja siirryttävä alueen vasempaan päähän. Kun ensimmäinen säie jatkaa synteesiä (jatkuva synteesi), yksisäikeinen alue laajenee oikealle. Tämä jättää nyt toisen säikeen monistumatta tällä uudella yksisäikeisellä alueella, ja DNA-synteesi on aloitettava uudelleen siirtymällä nykyisestä yksisäikeisen alueen oikeasta päästä kohti kyseisen säikeen ensimmäistä aloituspistettä. Tämä johtaa epäjatkuvaan synteesiin kyseistä säiettä pitkin.
6. Jos tymiinin osuus tietyn DNA-molekyylin emäksistä on 15 prosenttia, mikäprosenttiosuus emäksistä on sytosiinia?
7. Jos erään DNA-molekyylin GC-pitoisuus on 48 prosenttia, mitkä ovat neljän emäksen (A-, T-, G- ja C-emästen) prosentuaaliset osuudet kyseisessä molekyylissä?
Sekä A:n että T:n esiintymistiheys on (52%) = 26%.
8. E. coli -kromosomien, joissa jokainen typpiatomi on leimattu (eli jokainen typpiatomi on raskas isotooppi 15N tavanomaisen isotoopin 14N sijasta), annetaan lisääntyä ympäristössä, jossa kaikki typpi on 14N. Käyttämällä yhtenäistä viivaa raskaan polynukleotidiketjun kuvaamiseksi ja katkoviivaa kevyen ketjun kuvaamiseksi, piirrä seuraavat:
a.
Raskas vanhempien kromosomi ja ensimmäisen replikaation tuotteet sen jälkeen, kun ne on siirretty 14N-ympäristöön, olettaen, että kromosomi on yksi DNA:n kaksoiskierre ja että replikaatio on puolikonservatiivista.
b.
Kertaa osa a, mutta olettaen, että replikaatio on konservatiivista.
c.
Kertaa osa a, mutta olettaen, että kromosomi on itse asiassa kaksi vierekkäistä kaksoiskierteitä, joista kumpikin replikoituu puolikonservatiivisesti.
d.
Kertaa osa c, mutta oleta, että kumpikin vierekkäin oleva kaksoiskierre replikoituu konservatiivisesti ja että kromosomin kokonaisreplikaatio on semikonservatiivista.
e.
Kertaa osa d, mutta oleta, että kromosomin kokonaisreplikaatio on konservatiivista.
f.
Jos ensimmäisestä 14N:ssä tapahtuneesta jakautumisesta peräisin olevat tytärkromosomit kehrätään cesiumkloridin (CsCl) tiheysgradientissa ja saadaan yksi kaistale, mitkä osissa a-e esitetyistä mahdollisuuksista voidaan sulkea pois?Tarkastellaan uudelleen Meselson-Stahlin koetta: mitä se osoittaa?
9. R. Okazaki havaitsi, että E.coli:n DNA:n replikaation välittömiin tuotteisiin kuuluu yksijuosteisia DNA-fragmentteja, joiden pituus on noin 1000nukleotidia sen jälkeen, kun vastasyntetisoitu DNA on uutettu ja denaturoitu(sulatettu). Kun hän antoi DNA:n replikaation jatkua pidemmän aikaa, hän havaitsi, että näitä lyhyitä fragmentteja ja pitkiä yksisäikeisiä DNA-ketjuja esiintyi vähemmän uuttamisen ja denaturoinnin jälkeen. Selitä, miten tämä tulos saattaa liittyä siihen, että kaikki tunnetut DNA-polymeraasit syntetisoivatDNA:ta vain 5′ → 3′-suunnassa.
Tulokset viittaavat siihen, että DNA replikoituu lyhyiksi pätkiksi, jotka yhdistyvät sen jälkeen entsymaattisen toiminnan (DNA-ligaasi) avulla. Koska DNA:n replikaatio on kaksisuuntainen, koska DNA:n varrella on useita pisteitä, joissa replikaatio aloitetaan, ja koska DNA-polymeraasit toimivat vain 5′ → 3′-suunnassa, yksi DNA:n säie on aina entsyymin kannalta väärässä suunnassa. Tämä edellyttää synteesiä pätkittäin.
10. Kun kasvi- ja eläinsoluille annetaan tymidiinipulsseja eri aikoina solusyklin aikana, kromosomien heterokromaattiset alueet osoittautuvat poikkeuksetta ”myöhään replikoituviksi”. Voitteko kertoa, mikä biologinen merkitys tällä havainnolla voisi olla?
11. Rama-planeetalla DNA:ssa on kuusi nukleotidityyppiä: A, B, C, D, E ja F. A:ta ja B:tä kutsutaan marsiineiksi, C:tä ja D:tä areoriineiksi ja E:tä ja F:tä piriineiksi. Seuraavat säännöt pätevät kaikissa Raman DNA:ssa:
a.
Valmistakaa malli Raman DNA:n rakenteesta.
b.
Ramassa mitoosi tuottaa kolme tytärsolua. Ehdota DNA-mallisi replikaatiomallia pitäen tämä tosiasia mielessäsi.
c.
Pohdi meioosin prosessia Ramalla. Mitä kommentteja tai johtopäätöksiä voitte esittää?
12. Jos otat kolifagin øX174 DNA:n, huomaat, että sen koostumus on 25 prosenttia A, 33 prosenttia T, 24 prosenttia G ja 18 prosenttia C. Onko tämä koostumus järkevä Chargaffin sääntöjen kannalta? Miten tulkitsisitte tätä tulosta? Miten tällainen faagi voisi replikoida DNA:nsa?
Chargaffin sääntöjen mukaan A = T ja G = C. Koska tätä koostumusta ei ole havaittu, todennäköisin tulkinta on, että DNA on yksisäikeinen. Faagin olisi ensin syntetisoitava komplementaarinen säie, ennen kuin se voisi alkaa tehdä itsestään useita kopioita.
13. Lämpötilaa, jossa DNA-näyte denaturoituu, voidaan käyttää arvioimaan, kuinka suuri osa sen nukleotidipareista on G-C. Mihin tämä määritys perustuisi ja mitä DNA-näytteen korkea denaturaatiolämpötila osoittaisi?
Muista, että A:n ja T:n välillä on kaksi vetysidosta, kun taas G:n ja C:n välillä on kolme vetysidosta. Denaturoituminen edellyttää näiden sidosten katkaisemista, mikä vaatii energiaa. Mitä enemmän sidoksia on katkaistava, sitä enemmän energiaa on annettava. Näin ollen lämpötila, jossa tietty DNA-molekyyli denaturoituu, riippuu sen emäskoostumuksesta. Mitä korkeampi denaturointilämpötila on, sitä suurempi on G-C-parien osuus.
14. Oletetaan, että otat DNA:ta pienestä viruksesta, denaturoit sen ja annat sen yhdistyä muista kannoista otetun DNA:n kanssa, jotka kantavat joko deletion, inversion tai duplikaation. Mitä odotat näkeväsi elektronimikroskoopilla tarkasteltaessa?
15. Nisäkkäästä uutettu DNA denaturoidaan lämpödenaturoimalla ja jäähdytetään sitten hitaasti, jotta se voidaan eheyttää. Seuraavassa kuvaajassa esitetään saadut tulokset. Käyrässä on kaksi ”olkapäätä”. Ensimmäinen olkapää osoittaa, että DNA:ssa on hyvinnopeasti annealoituva osa – niin nopea, että annealoituminen tapahtuu ennen kuin säikeiden vuorovaikutukset tapahtuvat.
a.
Mitä tämä DNA:n osa voisi olla?
b.
Toinen olkapää on niin ikään nopeasti uudelleen annealoituva osa. Mihin tämä todiste viittaa?
16. Suunnittele testejä, joilla määritetään kromosomeissa olevien pitkälle toistuvien ja ainutkertaisten DNA-sekvenssien välinen fysikaalinen suhde. (Vihje: DNA-molekyylien kokoa on mahdollista varioida leikkauksen määrällä, jolle ne altistuvat.)
17. Virusten tiedetään aiheuttavan syöpää hiirille. Sinulla on puhdas valmiste virusDNA:ta, puhdas valmiste DNA:ta hiiren syöpäsolujen kromosomeista japuhdasta DNA:ta hiiren normaalien solujen kromosomeista. Virus-DNA yhdistyy spesifisesti syöpäsolujen DNA:n kanssa, mutta ei normaalien solujen DNA:n kanssa. Tutki tämän havainnon mahdollista geneettistä merkitystä, sen merkitystä molekyylitasolla ja sen lääketieteellistä merkitystä.
18. Ruth Kavenaugh ja Bruno Zimm kehittivät tekniikan, jolla mitataan pisimpien DNA-molekyylien maksimipituus liuoksessa. He tutkivat DNA-näytteitä kolmesta oikealla esitetystä Drosophilan karyotyypistä. He havaitsivat, että karyotyyppien a ja b pisimmät molekyylit olivat samanpituisia ja noin kaksi kertaa pidempiä kuin karyotyypin c pisin molekyyli. Tulkitse nämä tulokset.
Tiedot viittaavat siihen, että kukin kromosomi koostuu yhdestä yhtenäisestä DNA-molekyylistä ja että translokaatiot voivat muuttaa niiden kokoa. Osassa c näyttää siltä, että osa pisimmästä kromosomista on siirtynyt lyhyimpään kromosomiin.
19. Harlekiinikromosomitekniikassa sallitaan kolme replikaatiokierrosta bromodeoksiuridiinissa ja värjätään sitten kromosomit. Millaista tulosta odotat?
