In vivo RyR1:n väheneminen lihaksessa laukaisee ydintyyppisen myopatian

Generation of the RyR1Flox/Flox::HSA-Cre-ERT2-hiirimalli

Hiirilinja, jossa RYR1-geenin eksonien 9-11 molemmin puolin on lisätty loxP-kohtia (ns. RyR1Flox/Flox), paritettiin hiirilinjan HSA-Cre-ERT2 kanssa, joka ilmentää tamoksifeeniriippuvaista Cre-ERT2-rekombinaasia ihmisen luurankolihaksen α-aktiini-geenin kontrollin alaisena , jotta saatiin aikaan hiirilinja RyR1Flox/Flox/Flox:::HSA-Cre-ERT2. Tamoksifeeni-injektio indusoi Cre-ERT2-rekombinaasin aktivoitumisen selektiivisesti luurankolihaksessa, mikä johtaa eksonien 9-11 deleetioon ja RYR1-geenin katkeamiseen luurankolihaksessa tiukasti tamoksifeeniriippuvaisesti (kuva 1a). Syntyessään RyR1Flox/Flox::HSA-Cre-ERT2-hiiret olivat normaaleja, ja 2 kuukauden iässä, kun ne olivat nuoria aikuisia, rekombinaatio indusoitiin tamoksifeeni-injektiolla (tästä ajankohdasta lähtien rekombinoituneita eläimiä kutsuttiin nimellä RyR1-Rec). Molekulaarisia ja fysiologisia seurauksia tutkittiin edelleen ajan funktiona, aina 105 päivään rekombinaation indusoimisen jälkeen (kuva 1b). Kontrollieläimet (CTRL) ovat RyR1Flox/Flox-litteraatteja (ilman HSA-Cre-ERT2-siirtogeeniä), joihin on injisoitu tamoksifeeniä. Rekombinoitujen hiirten kokonaisfenotyypille 75 päivän iässä on ominaista kyfoosi, johon liittyy takaraajojen epänormaali liikkuvuus ja kahlaava kävely. Eläimet pystyvät edelleen seisomaan takajalkojensa varassa ruokailemassa, mutta ruokapellettejä oli systemaattisesti annettu suoraan häkkiin taudin edetessä. Eläimet liikkuvat edelleen häkissään 105 päivän iässä, eikä kuolleisuus ole lisääntynyt CTRL-tautiin verrattuna. Sekä urokset että naaraat sairastuivat. RyR1:n suhteellinen määrä mRNA-tasolla analysoitiin quadriceps-lihaksesta 15 päivän välein rekombinaation jälkeen RT-q-PCR:llä CTRL- ja RyR1-Rec-eläimissä (kuva 1c). RyR1-mRNA:n nopea lasku havaittiin, ja matala ja vakaa taso 21 % ± 4 % alkuarvosta saavutettiin jo 3 päivää tamoksifeeni-injektion jälkeen. Vähenemistä havaittiin kaikissa testatuissa lihaksissa 75 päivää rekombinaatioinduktion jälkeen (Quadriceps, tibialis anterior, EDL, soleus, lisätiedosto 1: kuva S1A). RyR1-proteiinin määrää analysoitiin edelleen käyttämällä kvantitatiivista Western blot -menetelmää quadriceps-lihaksen homogenoiduissa lihaksissa (Kuva 1d, e). Tämä määrä väheni asteittain ja saavutti noin 50 % alkuperäisestä arvosta 105 päivän jälkeen. RyR1-proteiinin vähenemistä ei enää havaittu pidemmällä aikavälillä (tietoja ei ole esitetty). RyR1-proteiinin määrä kvantifioitiin eri lihashomogenaateista 75 päivää rekombinaation jälkeen. Vähenemistä havaittiin kaikissa tutkituissa lihaksissa, vaikkakin jäljellä oleva määrä vaihteli hieman lihasten välillä; suurin määrä oli interosseuslihaksessa (64 % ± 5 %) ja pienin soleuslihaksessa (33 % ± 5 %) (Lisätiedosto 1: Kuva S1B).

RyR1-Rec-hiirillä lihas- ja ruumiinpainon sekä lihasvoiman asteittainen pieneneminen

RyR1:n vähentämisen seurauksia tutkittiin ensin koko eläimen tasolla. Aluksi samanpainoiset CTRL-eläimet saivat hitaasti painoa 24,4 ± 0,4 g:sta 30,6 ± 0,8 g:aan D90:ssä, kun taas RyR1-Rec-eläimet menettivät asteittain painoa 20,6 ± 1,3 g:aan D90:ssä (kuva 2a). Sekä urokset että naaraat kärsivät ja menettivät noin 13 % alkuperäisestä ruumiinpainostaan 75 päivän jälkeen (lisätiedosto 1: Kuva S1C). Tämä on seurausta kaikissa lihaksissa havaitusta painonpudotuksesta (Lisätiedosto 1: Kuva S1D). Lihasten yleisen suorituskyvyn testaamiseksi RyR1:n vähentämisen jälkeen eläimille tehtiin kaksi erilaista voimatestiä. Niiden annettiin ensin roikkua tarttumalla ristikkäislankapintaan kaikilla neljällä käpälällä 5 minuuttiin asti, jolloin laskeutumislatenssi kuvastaa lihasvoimaa. Tartuntatesti, joka suoritettiin viikoittain 105 päivän ajan (kuva 2b), osoitti, että RyR1-Rec-eläimet alkoivat menettää voimaa 20-30 päivää tamoksifeeni-injektion jälkeen, kun RyR1:n määrä oli noin 75-80 prosenttia alkuperäisestä arvosta, ja ne eivät pystyneet roikkumaan ristikossa noin 75 päivää tamoksifeeni-injektion jälkeen, kun RyR1:n määrä oli saavuttanut noin 60 prosentin tason. Lihasvoimaa arvioitiin myös 6 minuutin ei-invasiivisella gastrocnemius-lihaksen sähköstimulaatioprotokollalla, joka yhdistettiin anatomiseen magneettikuvaukseen (MRI) yleisanestesiassa. CTRL-eläinten sähköstimulaatioprotokollan aikana 30 päivää tamoksifeeni-injektion jälkeen (kuva 2c, D30) rekisteröitiin tyypillinen harjoitusprofiili, jossa lihasvoima oli aluksi vakaa ja väheni hitaasti lihaksen väsyessä. CTRL-ryhmässä D60:ssä ja D90:ssä harjoitusprofiili osoitti lihasvoiman parantuneen eläinten vanhetessa (kuva 2c). Sitä vastoin RyR1-Rec-eläinten suorituskyky, joka oli samanlainen kuin CTRL-eläimillä D30:ssä, heikkeni iän myötä. RyR1-Rec-eläimet eivät enää pystyneet suorittamaan harjoitusta D90:ssä (kuva 2c, RyR1-Rec D90). Gastrocnemiuksen tilavuus mitattuna MR-kuvilla (kuva 2d) pysyi vakaana CTRL-eläimillä D30:stä (161 ± 5 mm3) D90:een (164 ± 4 mm3). Sitä vastoin RyR1-Rec-hiirillä gastrocnemiuksen tilavuus oli merkittävästi pienempi kuin CTRL-hiirillä D30:stä lähtien (141 ± 3 mm3, p = 0,003), ja se pieneni edelleen 100 ± 3 mm3 :iin D60:ssä (p < 0,001 verrattuna CTRL-hiireen samassa iässä) ja 69 ± 4 mm3 :iin D90:ssä (p < 0,001 verrattuna CTRL-hiireen samassa iässä). Maksimaalinen spesifinen nykäysjännitys (absoluuttinen nykäysjännitys normalisoituna lihaksen tilavuuteen) vahvistaa, että molemmilla ryhmillä oli samanlainen lihasvoima D30:ssä (kuva 2e), mutta RyR1-Rec-eläinten voima väheni dramaattisesti, kun taas CTRL-eläimillä se lisääntyi iän myötä. Lisäksi gastrocnemius-lihaksen bioenergian muutoksia sähköstimulaation aikana arvioitiin noninvasiivisesti D60:ssä käyttämällä in vivo 31-fosforin (31P) MR-spektroskopiaa. Vaikka perustason intramyofibrillaarinen pH ei eronnut molempien ryhmien välillä (lisätiedosto 1: kuva S2A), asidoosin laajuus harjoituksen lopussa oli pienempi (p = 0,016) RyR1 Rec -eläimissä (lisätiedosto 1: kuva S2B), mikä viittaa siihen, että glykolyyttinen virtaus harjoituslihaksessa väheni näissä eläimissä. Lisäksi harjoituksen jälkeisen fosfokreatiinin resynteesin aikavakio (τPCr) oli merkittävästi lyhyempi (p = 0,047) RyR1-Rec-hiirillä (Lisätiedosto 1: Kuva S2C, D), mikä kuvastaa parempaa in vivo mitokondrioiden toimintaa. Itse asiassa PCr-synteesi liikunnan jälkeisen palautumisjakson aikana perustuu yksinomaan oksidatiiviseen ATP-synteesiin, joten τPCr katsotaan oksidatiivisen fosforylaatiokapasiteetin indeksiksi . Kaiken kaikkiaan nämä tulokset osoittavat, että RyR1:n asteittainen vähentäminen liittyy asteittaiseen painonpudotukseen ja lihasvoiman laskuun.

eristettyjen kuitujen fysiologiset ominaisuudet ovat heikentyneet RyR1-Rec-hiirillä

Lihastoiminnan muutosta karakterisoitiin tarkemmin yksittäisen lihaskuidun tasolla yhdistelmällä kokosolujännitteestä ja konfokaalisesta kuvantamisesta . T-tubulusverkko kuvattiin värjäämällä plasmakalvo di-8-aneppsilla. CTRL- ja RyR1-Rec-kuitujen välillä ei havaittu laadullista eroa verkostossa (kuva 3a, vasemmalla) tai kvantitatiivista eroa keskimääräisessä T-tubulustiheydessä, sen lisäksi, että keskimääräinen leposarkomeerin pituus lyheni hieman mutta merkittävästi (kuva 3a, oikealla olevat kuvaajat). Samanaikaisesti arvioitiin jännitteen aktivoimaa Ca2+ -tuloa DHPR:n kautta (kuva 3b-d) ja Ca2+ -vapautumisvirtaa RyR1:n kautta (kuva 3e-i). Verrattuna CTRL-kuituihin, RyR1-Rec-kuiduilla oli jännitteen aktivoimia DHPR Ca2+ -virtoja, joilla oli samanlainen aikakäyrä (Kuva 3b), mutta pienentynyt tiheys, kuten huippuvirran tiheys vs. jännite näissä kahdessa ryhmässä osoitti (Kuva 3c), mikä käännettiin 30 prosentin vähennykseksi maksimaalisessa konduktanssissa (Gmax) ilman siihen liittyvää muutosta muissa virran vs. jännitteen suhteen parametreissa (Kuva 3d). SR Ca2+ -vapautumisen jänniteriippuvuutta arvioitiin Ca2+-herkän väriaineen rhod-2:n viivakuvauksesta. RyR1-Rec-kuiduista otetut viivakuvat olivat laadullisesti samanlaisia kuin CTRL-kuiduista otetut kuvat (kuva 3e), ja niissä näkyi fluoresenssin nopea nousu T-tubuluksen kalvon depolarisaation yhteydessä, joka oli spatiaalisesti homogeeninen skannattua viivaa pitkin. SR Ca2+ -vapautumisnopeus (kuva 3g), joka on laskettu amplitudiltaan kasvavien depolarisoivien pulssien (kuva 3f) aiheuttamien rhod-2-fluoresenssin muutosten perusteella, oli RyR1-Rec-kuiduissa samankaltainen kuin CTRL-kuiduissa, mutta mikä tärkeintä, huippuarvot olivat pienemmät RyR1-Rec-kuiduissa. SR Ca2+ -vapautumisen huippunopeuden sovittaminen jännitteeseen nähden (kuva 3h-yläkaavio) osoitti, että Ca2+ -vapautumisen enimmäisnopeus väheni 25 prosenttia RyR1-Rec-ryhmässä (kuva 3i, Max), kaltevuuskerroin (k) väheni myös hieman, mutta merkittävästi, kun taas aktivoitumisen puolivälin jännite (V0,5) pysyi ennallaan. RyR1-Rec-kuiduissa havaittiin pieni (keskimäärin 1,3 ms) mutta merkittävä lisäys SR Ca2+ -vapautumisnopeuden ajasta huippuun RyR1-Rec-kuiduissa (kuva 3h, alin kuvaaja). Kuitujen sytosolisen Ca2+:n poistokyvyssä (SERCA-pumpun toiminta) ei havaittu muutoksia, jotka mitattiin matala-affiniteettisella Ca2+-herkällä väriaineella fluo-4 FF:llä muissa kuin EGTA-puskuriolosuhteissa (Lisätiedosto 1: Kuva S3). Kaiken kaikkiaan nämä tulokset osoittavat, että RyR1:n määrän 35 %:n väheneminen välikarsinoissa liittyy 30 %:n vähenemiseen DHPR:n kautta kulkevassa kalsiumvirrassa ja 25 %:n vähenemiseen RyR1:n kautta kulkevassa kalsiumvirrassa.

RyR1:n väheneminen vaikuttaa luurankolihaksen rakenteeseen

Tullaksemme paremmin selville näiden RyR1:n vähenemiseen liittyvien toiminnallisten muutosten perustan, lihaksen rakennetta tutkittiin RyR1-Rec-eläimillä D75:ssä rekombinaation jälkeen ja verrattiin niitä CTRL-eläimiin. Extensor digitorum longus (EDL), joka on nopeasti nykivä lihas, soleus, joka on hitaasti nykivä lihas, ja tibialis anterior (TA), joka on sekalihas, analysoitiin hematoksyliini-eosiini-, NADH- ja Gomori-trikromivärjäyksillä. TA:n värjäykset, jotka on esitetty kuvassa 4a, osoittavat RyR1-Rec-eläimillä epänormaalia lihaksen rakennetta ilman fibroosia tai keskeisiä ytimiä, mutta kuitujen surkastumista, joka vaikuttaa sekä tyypin I että tyypin II kuituihin (taulukko 2). Mitokondrioiden epäjärjestys, jolle on ominaista paikallinen kerääntyminen/poistuminen saman kuidun vierekkäisillä alueilla (nuolenkärki ja sisäkuva Kuva 4a) ja Gomori-trikromilla havaittu punaisen värjäytymisen kerääntyminen (Lisätiedosto 1: Fig. S4) havaittiin myös, ja se muistutti hiljattain potilailla kuvattuja pölyisiä ytimiä. Kuitujen surkastumista havaittiin EDL:ssä molemmissa kuitutyypeissä, vaikka väheneminen oli hieman merkittävämpää tyypin I kuiduissa (taulukko 2). CTRL- ja RyR1-Rec-hiirten poikittainen TA-leikkaus värjättiin RyR1- ja desmiinivasta-aineilla. RyR1-Rec-TA-leikkauksissa ei havaittu muutosta RyR1:n jakautumisessa tyypin I ja tyypin II kuitujen välillä, mikä osoittaa samanlaista RyR1:n vähenemistä kaikissa kuitutyypeissä (kuva 4b). Yllättäen desmiinijakaumassa havaittiin merkittävä muutos, joka lisääntyi huomattavasti pienissä tyypin I kuiduissa (kuva 4b): CTRL TA -leikkauksissa kaikissa kuiduissa oli samanlainen perifeerinen värjäytyminen, kun taas RyR1-Rec TA -leikkauksissa pienet tyypin I kuidut olivat voimakkaasti värjäytyneitä sekä kuitujen periferiassa että sytosolissa (sisäkuva 4b). Vaikka IF-värjäys ei ole kvantitatiivinen, nämä tulokset osoittavat, että RyR1:n väheneminen oli todennäköisesti homogeenista, eikä vierekkäisten kuitujen välillä ollut suuria eroja, kuten desmiinin kohdalla havaittiin, ja että Western blot -menetelmällä suoritettu kvantitatiivinen määritys on kunkin kuidun sisältämän proteiinin heijastuminen eikä niiden kuitujen keskiarvo, joissa on 0 % RyR1:tä, ja niiden kuitujen keskiarvo, joissa on 100 % RyR1:tä samassa lihaksessa.

Triadien järjestäytymistä tutkittiin tarkemmin immunofluoresenssimerkinnällä eristetyistä EDL-kuiduista (kuva 5a). Alfa-aktiniinin (Z-linjan merkkiaineena), triadiinin ja RyR1:n (triadien merkkiaineina) leimautuminen RyR1-Rec EDL-kuidussa osoitti, että RyR1:n määrän väheneminen johti kuitujen yleiseen disorganisaatioon, jossa triadien lokalisaatio oli epänormaali ja Z-linja katkennut, mutta triadiini ja RyR1 olivat edelleen osittain kolokalisoituneet. Vaikka triadit säilyivät Z-linjan molemmin puolin, Z-linja ei muodostanut suoraa linjaa kuten CTRL:ssä, vaan siinä oli sen sijaan monia mikrohäiriöitä (sisäkuva 5a). Lihaksen ultrastruktuuri analysoitiin elektronimikroskopialla RyR1-Rec EDL-kuiduista D75:ssä (kuva 5b). Joillakin alueilla rakenne oli suhteellisen säilynyt (Kuva 5b, vasen kuitu), kun taas jotkut viereiset alueet olivat erittäin epäjärjestäytyneitä, sarkomeerien säännöllisen organisaation häiriöt, mitokondrioiden epäjärjestäytyminen ja lukuisten kalvopinojen läsnäolo (Kuva 5b, nuolet, suurennettu insertissä), joita aiemmin kutsuttiin moninkertaisiksi kolmioiksi . Näiden moninkertaisten triadien morfologiset piirteet verrattuna normaaleihin yksittäisiin triadeihin on esitetty taulukossa 3, ja muita esimerkkejä on esitetty lisätiedostossa 1: Kuva S5. Oletetun T-tubuluksen leveyden, oletetun SR:n leveyden ja kalvojen välisen tilan (T-tubulus/SR) tarkka kvantifiointi (Lisätiedosto 1: Kuva S5) osoitti, että T-tubuluksen keskikoko kasvoi valtavasti näissä moninkertaisissa triadeissa (kaksinkertainen kasvu, joka oli 202 % T-tubuluksen koosta tavallisessa triadissa), kun taas SR:n keskileveys kasvoi vain hieman (+ 10 %) ja kalvojen välinen tila ei muuttunut. Nämä tulokset viittaavat RyR1-Rec-hiirten lihasten yleiseen rakenteelliseen epäjärjestykseen, joka liittyy kalvojen uudelleenmuotoiluun.

RyR1:n pelkistyminen liittyy lukuisten proteiinien määrän muuttumiseen

RyR1:n pelkistymisen seurauksia tutkittiin molekulaarisella tasolla kvantitatiivisella Western blotilla nelipäisessä nelivartalolihaksessa, jossa oli käytetty CTRL- tai RyR1-Rec-hiirten (8 eläintä kussakin ryhmässä) D75:ssä tamoksifeeni-injektion jälkeen (Kuva. 6). Lukuisien kalsiumin käsittelyyn suoraan tai epäsuorasti osallistuvien proteiinien suhteellinen määrä arvioitiin käyttäen vertailukohtana värjäytymättömän arvioinnin avulla määritettyä proteiinien kokonaismäärää . RyR1:n kvantifioinnissa ei havaittu eroa tämän menetelmän ja myosiinin raskaan ketjun käytön välillä vertailuproteiinina (vertailu kuvien 1 ja 6 välillä). Triadiinin isomuodon T95, kalsiumia sitovan proteiinin CSQ1, Ca2+-ATPaasi SERCA:n, mitokondriaalisen FoF1-ATPaasin ja DHPR:n alfa 1 -alayksikön määrässä ei havaittu merkittävää muutosta CRTL- ja RyR1-Rec-lihasten välillä (kuvat 6a, b). Sen sijaan STIM1:n (× 3,7 ± 1, p = 0,02), triadiinin isomuodon T51 (× 1,6 ± 0,1, p < 0,001), CLIMP63:n (× 1,8 ± 0,2, p = 0,004) ja ORAI1:n (× 3,7 ± 1, p = 0,017) määrässä havaittiin kasvua. Koska rakenneproteiini desmiinin lokalisaation muutos havaittiin immunofluoresenssimerkinnällä (kuva 5b), desmiinin ilmentymistaso kvantifioitiin myös, ja desmiinin määrässä havaittiin valtava kasvu (× 8,2 ± 1,2, p = 0,001). CLIMP63: n ja STIM1: n lokalisaatio RyR1-Rec EDL-kuiduissa analysoitiin käyttämällä immunofluoresenssimerkintää, eikä merkittävää muutosta havaittu (lisätiedosto 1: Kuva S6). RyR1-proteiinin vähenemiseen liittyi siis erilaisten kalsiumin säätelyyn tai lihasarkkitehtuuriin osallistuvien proteiinien lisääntyminen.

Autofagia muuttuu RyR1:n vähentymisen seurauksena

Autofagian muuttumista on havaittu joissakin myopatioissa . Tunnistaaksemme mekanismit, jotka johtavat RyR1-reduktion jälkeiseen lihasten surkastumiseen, etsimme muutoksia autofagian virtauksessa RyR1-Rec-lihaksissa. LC3 II:n, autofagosomien kalvoproteiinin, määrää arvioitiin kvantitatiivisella Western blotilla (Kuva 7a, b), ja LC3 II:n määrän havaittiin lisääntyneen (172 % ± 32 %, p = 0,03). Tämä autofagosomien lisääntyminen voisi heijastaa joko autofagosomien muodostumisen lisääntymistä (johtuen autofagiaprosessin lisääntymisestä) tai niiden fuusioitumisen vähenemistä lysosomien kanssa (ja siten autofagian hajoamisen estymistä). Autofagivirran muutoksen tarkkaa luonnetta analysoitiin edelleen määrittelemällä p62:n, tunnetun proteiinin, joka hajoaa spesifisesti autofagian kautta, määrä, joka myös lisääntyi merkittävästi (Kuva 7a, b, 172 % ± 22 %, p = 0,006). Tähän liittyvä LC3 II:n ja p62:n lisääntyminen RyR1-Rec-lihaksessa kontrolliin verrattuna viittasi siihen, että RyR1:n väheneminen liittyi näin ollen autofagian virran estämiseen. Lisäksi havaittiin kahden autofagian estäjän, mTOR:n ja S6-proteiinin (Kuva 7b, c), aktivaation (fosforylaation) lisääntyminen (P-mTOR/mTOR:n lisääntyminen 174 % ± 17 %, p = 0,01; P-S6/S6:n lisääntyminen 320 % ± 50 %, p < 0,001). Näiden kahden autofagian estäjän fosforylaation lisääntyminen RyR1-Rec-eläimissä verrattuna kontrolleihin viittasi entisestään siihen, että autofagian esto on vastuussa RyR1-Rec-eläinten lihasatrofiasta.

Ihmispotilaiden biopsioissa on samankaltaisia vikoja kuin RyR1-Rec-hiirillä havaituissa vioissa

Viimeisimmässä tutkimuksessamme, joka koski laajaa potilaskohorttia potilaita, joilla on resessiivinen synnynnäinen sydänlihassäryke , havaitsimme epätyypillisiä rakenteita, niin sanottuja pölymäisiä ytimiä (dusty cores, ”pölymäisiä ydinkerrostumia”), yli puolessa potilaista, joilla oli vähennys ryriinissä. Ne havaittiin moninkertaisella värjäyksellä, ja ne eroavat klassisesta keskusytimestä (hyvin määritellyt alueet, joilla ei ole oksidatiivista värjäystä) huonosti määritellyillä rajoilla, fokusoituneella myofibrillaarisella disorganisaatiolla, punertavan violetilla granulaarisen materiaalin kerrostumisella Gomori-trikromivärjäyksessä ja sekoittuneella alueella, jolla on vähentynyt ja/tai lisääntynyt entsymaattinen aktiivisuus oksidatiivisilla värjäyksillä mitattuna (Lisätiedosto 1: Kuva S7). Nämä rakenteelliset muutokset heijastavat hiirimallissamme havaittuja muutoksia (kuva 4 ja lisätiedosto 1: kuva S7). Siksi vertasimme edelleen uutta hiirimalliamme ja lihasbiopsioita potilailta, joilla oli RyR1-proteiinin väheneminen ja ”pölyiset ytimet”. Käyttämällä kvantitatiivista Western blot -menetelmää arvioitiin hiirimallissamme selvästi muuttuneiden proteiinien määrää myös viidellä potilaalla, joilla oli resessiivinen Dusty Core -tauti (kaksi RyR1-mutaatiota, jotka johtavat RyR1-proteiinin vähenemiseen – kuva 8a). Vertailukohtana käytettiin eri-ikäisiä kontrollibiopsioita (3,5-64 vuotta). Kaikilla potilailla havaittiin suuri RyR1-proteiinin väheneminen (keskimääräinen ilmentymistaso 19,8 % ± 2,2 % CTRL:stä, p < 0,001). Lisäksi havaittiin myös CLIMP63:n ja desmiinin lisääntymistä. RyR1:n vähenemiseen liittyi CLIMP63:n merkittävä lisääntyminen (keskimääräinen ekspressiotason nousu viisinkertaiseksi, 516 % ± 220 %). Lisäksi myös desmiinin ilmentymistaso lisääntyi potilailla rajusti kontrolliin verrattuna (keskimääräinen ilmentymistason lisääntyminen 240-kertaiseksi, 24 170 % ± 7 635 %). Käyttämällä elektronimikroskooppia potilasbiopsian ultrastruktuurin analysoimiseksi kaikkien potilaiden epäjärjestyneillä alueilla havaittiin monia kalvopinoja (kuva 8c, nuolet). Nämä alueet, jotka olivat samanlaisia kuin RyR1-Rec-lihaksessa havaitut pinot (kuva 4b), viittasivat yhteiseen mekanismiin sekä hiirissä että ihmisessä, joka johtaa näiden rakenteiden muodostumiseen RyR1-reduktion seurauksena. Kun muutokset ovat samanlaisia kuin Dusty Core -tautia sairastavilla potilailla, tämä malli muodostaa siten relevantin mallin patofysiologisten mekanismien tutkimiseen.

.