Fluoresoivia vasta-ainetekniikoita

Tekijä Benedette Cuffari, M.Sc.Arvostellut Emily Henderson, B.Sc.

Immunofluoresenssivärjäys on alkuperäisestä keksinnöstään vuonna 1942 lähtien säilynyt erittäin luotettavana ja tehokkaana tekniikkana monenlaisiin tutkimus- ja diagnostisiin tarkoituksiin.

Leukemiasolut, jotka on merkitty fluoresoivilla molekyyleillä. Image Credit: Vshivkova/.com

Yleisesti fluoresenssivasta-ainetekniikassa (FA) käytetään soluja tai vasta-ainetta, jonka vakioalue on merkitty fluoresoivalla leimalla, jota kutsutaan muuten fluorofooriksi. FA-tekniikat luokitellaan usein joko suoriin tai epäsuoriin.

Suora fluoresenssivasta-aine

Suorassa fluoresenssivasta-ainetekniikassa, jota voidaan muuten kutsua suoraksi immunofluoresenssiksi (Direct Immunofluorescence, DIF), käytetään yhtä ainoaa fluoresenssimerkittyä primaarivasta-ainetta, jota käytetään sitoutumaan kohdeantigeeniin. Kliinisesti käytettynä DIF on erityisen hyödyllinen bakteeritautien, kuten Streptococcus pyogenes -bakteerin, joka tunnetaan yleisemmin nimellä streptokokki, sekä keuhkokuumeen, joka on seurausta joko Mycoplasma pneumoniae- tai Legionella pneumophilia -lajeista, nopeassa diagnosoinnissa.

Tällaista diagnostiikkaa varten potilasnäyte asetetaan ensin mikroskooppilasialustalle ja sen jälkeen se altistetaan fluoresoivalle vasta-aineelle. Mahdollinen sitoutuminen fluoresenssimerkityn vasta-aineen ja kohdeantigeenin, joka näissä tilanteissa olisi bakteeri, välillä saa nämä aineet valaisemaan fluoresenssimikroskoopilla tutkittaessa.

Sen lisäksi, että DIF:ää käytetään diagnostisena välineenä, sitä käytetään laajalti myös tieteellisissä tutkimuksissa. Tällaisia tarkoituksia varten pakastettu kudosnäyte, joka on leikattu 5 tai 6 mikrometrin (µm) ohuiksi leikkeiksi, asetetaan lasilevylle.

Levyjä inkuboidaan sitten fluoresoivalla merkityllä vasta-aineella, joka tyypillisesti sisältää paneelin vasta-aineita, jotka on suunnattu IgA-, IgG- ja IgM-vasta-aineiden isotyyppejä vastaan sekä komplementti 3:aa vastaan, joka on suunnattu kiinnostavaa antigeenia vastaan.

Huomaa, että tämäntyyppisessä tutkimuksessa käytettävän vasta-aineen konsentraatio perustuu aiempiin kokeisiin, joissa on varmistettu, millä konsentraatiolla saavutetaan korkein signaali-taustasuhde.

Kun objektioita on inkuboitu vähintään 30 minuuttia pimeässä ja huoneenlämmössä, objektilasit pestään ja kuvataan fluoresenssimikroskoopilla.

Image Credit: anyaivanova/.com

Epäsuora fluoresenssivasta-aine

Epäsuora IF (IIF) tai epäsuora FA (IFA) on kaksivaiheinen prosessi verrattuna DIF:ssä käytettyyn yksivaiheiseen tekniikkaan, joka alkaa levittämällä näytteeseen merkitsemätöntä primaarivasta-ainetta, joka on suunnattu kohdeantigeenia vastaan. IIF:n toisessa vaiheessa käytetään fluoresenssilla leimattua sekundääristä vasta-ainetta, joka on suunnattu primaarisen vasta-aineen Fc-osaa vastaan.

Vaikka IIF:ää pidetään monimutkaisempana kuin DIF:ää, koska sen suorittaminen kestää pidempään ja se edellyttää kahden yhteensopivan vasta-aineen käyttöä, se on herkkyysominaisuuksiltaan ylivoimainen.

Joitakin yleisimpiä kliinisiä sovellutuksia IFA-testeille ovat muun muassa ne, joita käytetään kupan diagnosointiin. Tämäntyyppistä IFA-testiä varten eristetään T. palladium -soluja, jotka on aiemmin eristetty tutkimuseläimestä, ja ne asetetaan lasilevyn pinnalle. T. palladium -solujen päälle levitetään sitten potilaalta hankittua seerumia, jotta anti-treponemaaliset vasta-aineet, jos niitä on, voivat sitoutua kiinnitettyihin antigeeneihin.

Kun potilaan seeruminäyte on pesty pois, siihen lisätään sekundaarivasta-aine, joka on merkitty fluorofoorilla. Positiivinen syfilis-tulos valaisee kaikki sekundäärisen vasta-aineen ja fluorofoorikonjugaatin kompleksit.

Toinen IFA-tyyppi, jota käytetään laajalti kliinisissä ympäristöissä, on se, jota käytetään systeemisen lupus erythematosuksen (SLE) diagnosointiin. SLE:tä, joka on autoimmuunisairaus, sairastavilla potilailla on lisääntynyt verenkierrossa olevien ydinvastaisten autovasta-aineiden (ANA) määrä, jotka kohdistuvat sekä DNA:ta että erilaisia DNA:han sitoutuvia proteiineja vastaan.

Tässä IFA-testityypissä soluja viljellään ja asetetaan sitten lasilevylle. Kutakin objektilasia inkuboidaan sitten eri pitoisuudella potilaan vasta-ainetta, joka sitten pestään sitomattomien proteiinien poistamiseksi.

Pesuvaiheen jälkeen objektilasille lisätään fluoresenssilla leimattu sekundäärivasta-aine, joka ANA-testissä on antihuman IgG, ja sen annetaan inkuboitua. ANA:n titteri seerumissa saadaan sitten korkeimmasta seerumin laimennoksesta, joka osoitti fluoresenssia, ja sitä käytetään SLE-diagnoosin määrittämiseen.

Virtaussytometria

Kolmas fluoresoivan vasta-aineen tekniikkatyyppi sisältää virtaussytometrian, joka on automatisoitu solujen laskentajärjestelmä, jota voidaan käyttää tiettyjen solujen kvantifioimiseen monimutkaisissa seoksissa, kuten veressä tai seerumissa.

Tyypillinen virtaussytometriakoe aloitetaan inkuboimalla fluoresoivasti leimattua vasta-ainetta, joka on kohdennettu tiettyä solujen osapopulaatiota vastaan, kuten anti-CD4, joka voi sitoutua glykoproteiiniin CD4, joka löytyy erilaisten immuunisolujen, kuten T-apulaattorisolujen, monosyyttien ja makrofagien, pinnalta. Virtaussytometrialla voidaan myös kvantifioida useiden solutyyppien läsnäolo käyttämällä sopivia soluvalmistajia.

Kun inkubaatio on suoritettu, näyte viedään virtaussytometriin. Tässä laitteessa kapea kapillaari pakottaa näytteessä olevat solut kulkemaan sen läpi yhtenä rivinä. Kun solut liikkuvat kapillaarin läpi, laseria käytetään aktivoimaan ja herättämään kaikki fluorofoorilla merkityt solut.

Kunkin herätetyn solun fluoresenssin voimakkuus mitataan sitten sekä eteen- että sivusirontailmaisimilla, ja se kuvataan histogrammilla analysointia varten. Kvantifiointitarkoitusten lisäksi sekä virtaussytometriaa että immunofluoresenssia voidaan käyttää solujen lajitteluun puhdistettuihin osapopulaatioihin tutkimustarkoituksia varten tekniikalla, joka tunnetaan nimellä fluoresenssiaktivoitu solusortteri (FACS, fluorescence-activated cell sorter).

• Odell, I. D., & Cook, D. (2013). Immunofluoresenssitekniikat. Journal of Investigative Dermatology 133. doi:10.1038/jid.2012.455.
• Parker, N., Schneegurt, M., Tu, A. T., et al. (2016). Luku 20.5 Fluoresoivat vasta-ainetekniikat. In: Microbiology. Accessed from https://openstax.org/books/microbiology/pages/20-5-fluorescent-antibody-techniques.
• Betterle, C., & Zanchetta, R. (2012). Immunofluoresenssitekniikat endokriinisten autoimmuunisairauksien diagnostiikassa. Autoimmunity Highlights 3(2); 67-78. doi:10.1007/s13317-012-0034-3.

Lisälukemista

• Kaikki vasta-aineet Sisältö
• VHH-vasta-aineet (nanokehot) Edut ja rajoitukset
• Vasta-aineiden valinta DNA-origami-telineiden avulla
• Histoni-desasetylaasi (HDAC)-vasta-aineiden käyttökohteet vuonna Research
• Using Antibodies for Parkinson’s Disease Research

Written by

Benedette Cuffari

Valmistuttuaan luonnontieteiden kandidaatin tutkinnon toksikologiassa, jossa on kaksi sivuaineopintoa espanjassa ja kemiassa, vuonna 2016, Benedette jatkoi opintojaan valmistuakseen toksikologian maisteriksi toukokuussa 2018. Jatko-opintojensa aikana Benedette tutki mekloretamiinin ja bendamustiinin dermatotoksisuutta; ne ovat kaksi typpisinappialkyloivaa ainetta, joita käytetään syöpähoidossa.

Sitaatit