- Two types of models describing enzyme kinetics: sQ- ja tQ-mallit
- Estimointi tQ-mallilla on vääristymätöntä mille tahansa entsyymi- ja substraattikonsentraatioiden yhdistelmälle
- K catin ja K M:n samanaikainen estimointi kärsii tunnistettavuuden puutteesta
- Yhdistetyt tiedot eri kokeista mahdollistavat tarkan ja täsmällisen estimoinnin tQ-mallilla
- Optimaalinen koesuunnittelu tarkkaa ja tehokasta estimointia varten tQ-mallilla
Two types of models describing enzyme kinetics: sQ- ja tQ-mallit
Perusentsyymireaktio koostuu yhdestä entsyymistä ja yhdestä substraatista, jossa vapaa entsyymi (E) sitoutuu reversiibelisti substraatin (S) kanssa muodostaen kompleksin (C), ja kompleksi dissosioituu irreversiibelisti tuotteeksi (P) ja vapaaksi entsyymiksi:
jossa entsyymin kokonaiskonsentraatio (E T ≡ C + E) ja substraatin ja tuotteen kokonaiskonsentraatio (S T ≡ S + C + P) säilyvät. Suosittu malli, joka kuvaa tuotteen kertymistä ajan kuluessa, perustuu MM-yhtälöön seuraavasti (ks. yksityiskohtainen derivointi Supplementary Method):
jossa K M = (k b + k cat )/k f on Michaelis-Mentenin vakio, ja k cat on katalyyttinen vakio. Tätä sQ-mallia, joka on johdettu standardilla QSSA:lla, on käytetty laajalti kineettisten parametrien, K M ja k cat, arvioimiseen tuotteen etenemiskäyrästä8,9,10,11,23,25. Toinen tuotteen kertymistä kuvaava malli on johdettu kokonais-QSSA:n avulla; se kehitettiin myöhemmin kuin sQ-malli, joten se on saanut vähemmän huomiota parametrien arvioinnissa26,27,28,29:
Vaikka tämä tQ-malli on monimutkaisempi kuin sQ-malli, se on tarkka laajemmilla alueilla kuin sQ-malli. Erityisesti sQ-malli on tarkka, kun
joka edellyttää pientä entsyymikonsentraatiota7,14. Toisaalta tQ-malli on tarkka, kun
jossa K = k b /k f on dissosiaatiovakio27,28,29. Tärkeää on, että tämä ehto on yleisesti voimassa ja siten tQ-malli, toisin kuin sQ-malli, on tarkka myös silloin, kun entsyymiä on liikaa. Katso lisätietoja14,30.
Seuraavaksi tutkittiin molemmilla malleilla suoritettujen stokastisten simulaatioiden tarkkuutta. Erityisesti vertasimme stokastisia simulaatioita, joissa käytettiin Gillespie-algoritmia, joka perustui joko alkuperäisen täydellisen mallin (kuvattu taulukossa S1), sQ-mallin (taulukko S2) tai tQ-mallin (taulukko S3) propenssifunktioihin yhdeksässä eri tilassa31,32,33,34,35,36: E T on joko pienempi, samankaltainen tai suurempi kuin K M, ja S T on myös joko pienempi, samankaltainen tai suurempi kuin K M (kuva 1). sQ-mallin stokastiset simulaatiot eivät lähennä alkuperäisen täydellisen mallin simulaatioita, kun E T ei ole alhainen (eli E T ei ole pienempi kuin S T eikä K M ). Toisaalta stokastiset simulaatiot, joissa käytetään tQ-mallia, ovat tarkkoja kaikissa olosuhteissa (kuva 1), mikä vastaa hiljattain tehtyä tutkimusta, jonka mukaan sQ- ja tQ-malleilla tehdyt stokastiset simulaatiot ovat tarkkoja, kun niiden deterministiset kelpoisuusedellytykset täyttyvät (yhtälöt (3) ja (4))37,38. Kaiken kaikkiaan tQ-malli on voimassa laajemmalla alueella kuin sQ-malli sekä deterministisessä että stokastisessa mielessä.
Mikäli sQ-malli ei pysty approksimoimaan alkuperäistä täydellistä mallia E T:n kasvaessa, tQ-malli on tarkka E T:sta riippumatta. Alkuperäisen täyden mallin (taulukko S1), sQ-mallin (taulukko S2) ja tQ-mallin (taulukko S3) stokastiset simulaatiot suoritettiin, kun S T = 0,2, 2 tai 80 nM ja E T = 0,2, 2 tai 40 nM. Huomaa, että nämä pitoisuudet ovat joko pienempiä, samanlaisia tai suurempia kuin K M ≈ 2 nM. Tässä viivat ja värilliset alueet edustavat 104 stokastisen simulaation keskimääräistä liikerataa ja vaihteluväliä (±2σ keskiarvosta).
Estimointi tQ-mallilla on vääristymätöntä mille tahansa entsyymi- ja substraattikonsentraatioiden yhdistelmälle
Koska tQ-malli on tarkempi laajemmalla olosuhteiden vaihteluvälillä kuin sQ-malli (kuva 1), oletimme, että tQ-malliin perustuva parametrien estimointi on tarkkaa myös yleisemmissä olosuhteissa. Tutkiaksemme tätä hypoteesia generoimme ensin 102 kohinaista P:n etenemiskäyrää alkuperäisen täyden mallin stokastisista simulaatioista (Kuva S1). Sitten päättelimme parametrit (k cat ja K M ) näistä simuloiduista datasarjoista soveltamalla Bayesin päättelyä joko sQ- tai tQ-malliin perustuvilla todennäköisyysfunktioilla heikosti informatiivisilla gammaprioreilla (Kuva S2) (katso lisätietoja menetelmistä). Huomaa, että koko tässä tutkimuksessa olemme käyttäneet simuloituja tuotekehityskäyriä (esim. Kuva S1), koska meidän on tiedettävä parametrien todelliset arvot sQ-malliin ja tQ-malliin perustuvien estimointien tarkkaa vertailua varten.
Keskityimme ensin k-kissan estimointiin olettaen, että K M:n arvo tunnetaan. Kun E T on alhainen, jolloin sekä sQ- että tQ-mallit ovat tarkkoja (kuva 1 vasemmalla), molemmilla malleilla saadut posterioriset otokset ovat samankaltaisia ja kuvaavat menestyksekkäästi k catin todellista arvoa (kuva 2a vasemmalla). Molemmilla malleilla saadut posterioriset näytteet ovat samankaltaisia, koska kun E T on pieni ja siten \({E}_{T}\ll {S}_{T}+{K}_{M}\), molemmat mallit (yhtälöt 1 ja 2) ovat suunnilleen ekvivalentteja seuraavasti:
jossa ensimmäinen approksimaatio tulee Taylorin ekspansiosta \({E}_{T}({S}_{T}-P)/({E}_{T}+{K}_{M}+{S}_{T}-P)\ll 1 \) (ks. tarkemmin27,28,29). Kun siis \({E}_{T}\ll {S}_{T}+{K}_{M}\) ja siten sQ-malli on tarkka, sQ- ja tQ-malleilla tehtyjen arvioiden pitäisi olla samanlaisia. Toisaalta, kun E T on suuri, niissä on selviä eroja (kuva 2a oikealla): sQ-mallilla saadut posterioriset otokset osoittavat suuria virheitä, kun taas tQ-mallilla saadut otokset kuvaavat tarkasti k cat:n todellista arvoa.
Yksittäisen parametrin (k cat tai K M ) estimoinnit joko sQ- tai tQ-mallilla. Kullekin olosuhteelle (S T = 0,2, 2 tai 80 nM ja E T = 0,2, 2 tai 40 nM) saatiin 105 posteriorista otosta joko k cat:lle (a) tai K M:lle (b) soveltamalla bayesiläistä päättelyä 102:een kohinaiseen datasarjaan (kuva S1) (ks. tarkemmat tiedot menetelmistä). Kun k cat otetaan näytteeksi, K M on kiinnitetty todelliseen arvoonsa (a) ja päinvastoin (b). Tässä vihreät kolmiot osoittavat parametrien todelliset arvot. Kun sQ-mallilla saadut k catin ja K M:n estimaatit vääristyvät E T:n kasvaessa, tQ-mallilla saaduilla estimaateilla on vähäinen vääristymä olosuhteista riippumatta (ks. kuva S3 estimaattien laatikkodiagrammit). E T:n tai S T:n kasvaessa K M:n posteriorinen varianssi kasvaa tQ-mallia käytettäessä.
Samankaltaisia tuloksia havaitaan myös posterioristen keskiarvojen ja posterioristen variaatiokertoimien (CV) laatikkodiagrammeissa (Kuva S3a,b). Kun sQ-mallilla saadut posterioriset keskiarvot ovat vinoutuneita, kun E T on korkea, tQ-mallilla saadut keskiarvot ovat tarkkoja kaikissa olosuhteissa (kuva S3a). Erityisesti posterioristen keskiarvojen kapeat jakaumat osoittavat, että k catin estimointi tQ-mallilla on vankka aineiston kohinaa vastaan (Kuva S1). Lisäksi posterioriset CV:t ovat paljon pienempiä kuin prioriset CV:t (Kuva S3b), mikä osoittaa k cat:n tarkkaa estimointia tQ-mallilla.
Seuraavaksi estimoitiin K M olettaen, että k cat:n arvo tunnetaan (Kuva 2b). SQ-mallilla saadut K M:n posterioriset otokset osoittavat jälleen virheitä, jotka kasvavat E T:n kasvaessa. Huomaa, että K M:n estimaatit vinoutuvat ylöspäin, mikä tarkoittaa, että K M:n posterioriestimaattien käyttäminen MM-yhtälön (\({K}_{M}\gg {E}_{T}\)) vahvistamiseen voi olla harhaanjohtavaa. Toisaalta tQ-mallilla saadut K M -estimaatit ovat vähän vinoutuneita kaikissa olosuhteissa. Toisin kuin k catin kapeat posteriorijakaumat (kuva 2a), tQ-mallilla saadut K M:n jakaumat ovat kuitenkin leveämpiä, joten tarkkuus vähenee E T:n tai S T:n kasvaessa (kuva 2b). Nämä mallit havaitaan myös posterioristen keskiarvojen ja posterioristen CV:iden laatikkokuvioissa (kuvat S3c,d). Tunnistettavuusongelma syntyy, koska kun \({E}_{T}\gg {K}_{M}\) tai \({S}_{T}\gg {K}_{M}\) ja näin ollen \({E}_{T}+{S}_{T}\gg {K}_{M}\), K M on mitätön tQ-mallissa (Yht. 2), seuraavasti:
Erityisesti, kun K M on liian pieni, K M:n arvolla ei ole juurikaan vaikutusta tQ-mallin dynamiikkaan ja siten K M on rakenteellisesti tunnistamaton. Kaiken kaikkiaan K M:n estimaatit sekä sQ- että tQ-mallilla eivät ole tyydyttäviä, vaikkakin eri syistä: sQ-mallilla tehdyt estimaatit voivat olla vinoutuneita ja tQ-mallilla tehdyt estimaatit voivat olla rakenteellisesti tunnistamattomia (kuva 2b). Samanlaisia malleja havaittiin myös silloin, kun annettiin informatiivisempi ennakko (Kuva S4). Erityisesti sQ-mallilla saadut estimaatit osoittivat informatiivisenkin priorin kanssa edelleen huomattavaa virhettä E T:n kasvaessa.
K catin ja K M:n samanaikainen estimointi kärsii tunnistettavuuden puutteesta
Seuraavaksi tarkasteltiin kahden parametrin, k catin ja K M:n, samanaikaista estimointia, mikä on tyypillinen tavoite entsyymikineettisessä tutkimuksessa. Samoilla gammaprioreilla, joita käytettiin yhden parametrin estimoinnissa (kuva 2), molemmilla malleilla saatujen posterioristen otosten jakaumat laajenivat kokonaisuudessaan (kuva 3). Löytääksemme syyn tällaiseen epätarkkaan estimointiin analysoimme posterioristen k cat- ja K M -näytteiden hajontakuvioita (kuva 4). Kun \({S}_{T}\ll {K}_{M}\) (Kuva. 4a-c), sQ-mallilla saadut posterioriset k cat- ja K M -näytteet osoittivat vahvaa korrelaatiota, koska sQ-mallin dynamiikka riippuu vain suhteesta k cat /K M , kuten seuraavassa approksimaatiossa nähdään:
jossa käytetään \({K}_{M}\gg {S}_{T}\\ge {S}_{T}-P\\)\)-kohtaa. Toisaalta, kun \({S}_{T}\gg {K}_{M}\) (kuva 4g-i), sQ-mallin hajontakuvio muuttuu vaakasuoraksi, mikä osoittaa rakenteen tunnistamattomuutta K M . K M:n arvolla ei nimittäin ole juuri mitään vaikutusta sQ-mallin dynamiikkaan, kuten seuraavasta approksimaatiosta nähdään:
jossa K M + S T ≈ S S T käytetään muotoa \({S}_{T} \gg {K}_{M} \)\). Tällainen parametrien tunnistettavuuden puute, kun käytetään \({S}_{T}\ll {K}_{M}\) tai \({S}_{T}\gg {K}_{M}\), on yhdenmukainen aiempien tutkimusten kanssa, joissa suositellaan S T ≈ K M:n käyttämistä tarkempaan estimointiin22,23. Estimaatit ovat kuitenkin edelleen epätarkkoja, vaikka S T ≈ K M käytettäisiinkin (kuvat 3a ja b keskellä). Lisäksi E T:n kasvaessa sQ-mallilla saadut estimaatit ovat vinoutuneita (kuva 3) kuten yhden parametrin estimoinnissa (kuva 2). Tämän analyysin perusteella näyttää siltä, että k catin ja K M:n samanaikainen estimointi sQ-mallilla on haastavaa sekä tunnistettavuus- että harhaongelmien vuoksi.
Kahden parametrin (k cat ja K M ) samanaikainen estimointi joko sQ- tai tQ-mallilla. Samoista 102 datasarjasta (kuva S1), joita käytettiin yhden parametrin estimoinnissa (kuva 2), saatiin 105 posteriorista otosta k cat:lle (a) ja K M:lle (b) yhdessä. Vaikka priorit ovat samat, posteriorijakaumista tulee laajempia kuin yhden parametrin estimoinnissa (kuva 2). Tässä vihreät kolmiot kuvaavat k catin tai K M:n todellisia arvoja .
Kahden parametrin estimoinnilla saatujen posteriorinäytteiden hajontakuvioita (kuva 3). Hajontakuviot viittaavat kahdenlaiseen rakenteen tunnistamattomuuteen: vahvaan korrelaatioon k cat:n ja K M:n välillä ja K M:n tunnistamattomuuteen, joka on esitetty vaakasuorana kuviona. Positiivisesti korreloivat tQ-mallin hajontakuviot muuttuvat vaakasuoriksi, kun näytteeksi otettu K M on paljon pienempi kuin S T + E T (katkoviivat harmaat viivat). Tässä vihreät kolmiot edustavat parametrien todellisia arvoja.
Kun \({E}_{T}\gg {K}_{M}\) tai \({S}_{T}\gg {K}_{M}\)), K M:llä on mitätön vaikutus tQ-mallin dynamiikkaan (yhtälö 6), ja näin ollen vain k k kissa voitiin tunnistaa yksittäisen parametrin estimoinnissa (kuvat 2 a ja b oikealla tai alla). Vastaavasti, kun sekä k cat että K M päätellään samanaikaisesti tQ-mallin kanssa, vain k catin estimointi on tarkkaa ja täsmällistä (kuva 3a ja b oikealla tai alhaalla), kuten vaakasuorat hajontakuviot k catin todellista arvoa pitkin osoittavat (kuva 4c,f,g-i). Muissa tapauksissa (kun \({E}_{T}\gg {K}_{M}\) tai \({S}_{T}\gg {K}_{M}\)) molempien parametrien posteriorinen varianssi kasvaa dramaattisesti verrattuna yhden parametrin estimointiin (kuvat 2 ja 3 vasemmalla ja ylhäällä). Tällainen epätarkka estimointi johtuu hajontakuvioiden mukaan kahdesta lähteestä (kuvat 4a,b,d,e). Kun k cat ja K M pienenevät yhdessä, tQ-mallin käyttäytyminen muuttuu vähän kuin SQ-mallin (yhtälö 5), mikä johtaa voimakkaaseen korrelaatioon k catin ja K M:n posterioristen otosten välillä. Kun K M:n estimaatit pienenevät yhdessä k cat:n estimaattien kanssa niin, että niistä tulee paljon pienempiä kuin E T + S T (kuvan 4 katkoviiva), tQ-malli ei enää riipu K M:n arvosta, kuten yhtälöstä 6 käy ilmi, ja siten hajontakuviot muuttuvat vaakasuoriksi.
Yhdistetyt tiedot eri kokeista mahdollistavat tarkan ja täsmällisen estimoinnin tQ-mallilla
Kuten edellä on osoitettu, sekä k cat:n että K M:n estimoinnissa yhden etenemiskäyrän avulla kärsitään huomattavasta harhasta ja tunnistettavuuden puutteesta (kuvat 3 ja 4), mikä vastaa aiempia tutkimuksia, joissa on raportoitu, että yhdestä kokeesta saatu etenemiskäyrä ei riitä molempien muuttujien samanaikaiseen tunnistamiseen19. Näin ollen tässä tutkimme, voiko useiden eri koeolosuhteissa saatujen aikakäyrädatasarjojen käyttö parantaa estimointia.
Tyypillisissä in vitro -määrityksissä etenemiskäyrät mitataan joko kiinteällä S T:llä ja vaihtelevalla E T:llä tai kiinteällä E T:llä ja vaihtelevalla S T:llä 8,9,10,11,39. Tarkastellaan ensin tapausta, jossa etenemiskäyrät mitataan kiinteällä S T:llä ja vaihtelevalla E T:llä. Tarkemmin sanottuna sekä matalan että korkean E T:n edistymiskäyriä käytetään estimoimaan parametreja kiinteälle S T:lle eri tasoilla (kuva S1 ylhäällä ja alhaalla). Tässä tapauksessa sQ-mallilla saadut posterioriset otokset osoittavat huomattavia virheitä, kun käytetään korkean E T:n tietoja (kuvat 5a ja S5). Toisaalta tQ-mallilla saadut posterioriset näytteet kuvaavat tarkasti sekä k catin että K M:n todellisia arvoja pienellä varianssilla (kuvat 5a ja S5). Tällainen parannus johtuu siitä, että matalalla ja korkealla E T:llä saadut tiedot tarjoavat erityyppistä tietoa parametrien estimointia varten. Vaikka K M ei ole tunnistettavissa korkean E T:n datasta, k cat voidaan arvioida tarkasti tQ-mallin avulla (kuvat 4c,f,i). Tällainen k cat:n tarkka estimointi korkean E T:n datasta voi estää k cat:n ja K M:n välisen korrelaation, kun ne estimoidaan matalan E T:n datasta (kuvat 4a,d). Itse asiassa tQ-mallin kapeat hajontakuviot (kuva 5b vasemmalla ja keskellä) ovatkin kahden hajontakuvion leikkauspisteitä, horisontaalisen, joka on saatu korkeiden E T-arvojen perusteella (kuva 4c,f), ja ei-horisontaalisen, joka on saatu matalien E T-arvojen perusteella (kuva 4a,d). Kun S T on korkea, myös matalasta E T:stä saatu hajontakuvio muuttuu vaakasuoraksi (kuva 4c), jolloin yhdistettyjen tietojen käytön synergistinen vaikutus vähenee (kuva 5a,b oikealla). Kaiken kaikkiaan tQ-malli voi arvioida tarkasti molemmat parametrit matalan E T:n ja korkean E T:n tietojen yhdistelmästä, kun S T ei ole paljon suurempi kuin K M . On huomattava, että tällainen pieni S T on suositeltava in vitro -kokeissa24,39,40,41 ja se pätee useimpiin fysiologisiin olosuhteisiin24.
Kun matalalla E T:llä ja korkealla E T:llä saatuja dataa käytetään yhdessä, tQ-mallilla, mutta ei sQ-mallilla saatujen estimaattien täsmällisyys ja tarkkuus paranevat. (a) Posterioriset otokset on johdettu käyttämällä datasarjoja E T = 0,2 nM (kuva S1 ylhäällä) ja E T = 40 nM (kuva S1 alhaalla) yhdessä joko S T = 0,2, 2 tai 80 nM:lle. TQ-mallin posteriorinen varianssi pienenee dramaattisesti yhden parametrin estimoinnin tasolle (kuva 2). SQ-mallin estimaateissa on kuitenkin huomattavaa harhaa. Tässä vihreät kolmiot edustavat k catin tai K M:n todellisia arvoja. (b) Posterioristen otosten hajontakuviot. Tässä vihreät kolmiot, siniset ympyrät ja punaiset neliöt edustavat todellisia arvoja, sQ-mallin posteriorisia keskiarvoja ja tQ-mallin posteriorisia keskiarvoja.
Seuraavaksi tarkastelemme tapausta, jossa etenemiskäyrät mitataan kiinteällä E T:llä ja vaihtelevalla S T:llä. Tarkemmin sanottuna kahden matalasta ja korkeasta S T:stä saadun etenemiskäyrän yhdistelmää käytetään päättelemään parametreja kiinteälle E T:lle eri tasoilla (kuva S1 vasemmalla ja oikealla). Kun E T on alhainen ja siten sQ- ja tQ-mallit käyttäytyvät samalla tavalla (yhtälö 5), molemmilla malleilla saadut posterioriset otokset kuvaavat tarkasti k catin ja K M:n todellisia arvoja (kuvat 6a vasen ja S6). Kapea hajontakuvio (kuva 6b vasemmalla) saadaan taas matalan S T:n ei-vaakasuoran hajontakuvion (kuva 4a) ja korkean S T:n vaakasuoran hajontakuvion (kuva 4g) leikkauspisteenä. E T:n kasvaessa ja siten sQ-mallin muuttuessa epätarkemmaksi sQ-mallilla saadut tulokset ovat kuitenkin odotetusti vinoutuneita (kuvat 6a oikealla ja S6). Kun taas tQ-mallilla saaduissa estimaateissa ei havaita tällaisia harhoja, K M -estimaattien tarkkuus pienenee E T:n kasvaessa, kuten yhden parametrin estimoinnissa (kuva 2 ja yhtälö 6).
Estimointi, jossa käytettiin matalalla S T:llä ja korkealla S T:llä saatuja aineistoja yhdessä. (a) Posterioriset otokset on päätelty käyttäen datasarjoja S T = 0,2 nM (kuva S1 vasemmalla) ja S T = 80 nM (kuva S1 oikealla) yhdessä joko E T = 0,2, 2 tai 40 nM:n osalta. Kun E T on alhainen, sekä sQ- että tQ-mallit mahdollistavat tarkan ja täsmällisen arvioinnin. Kun E T kasvaa, sQ-mallilla saadut estimaatit muuttuvat epätarkoiksi ja tQ-mallilla saadut K M -estimaatit epätarkemmiksi, samoin kuin yhden parametrin estimoinnissa (kuva 2). Tässä vihreät kolmiot edustavat k catin tai K M:n todellisia arvoja. (b) Posterioristen otosten hajontakuviot. Tässä vihreät kolmiot, siniset ympyrät ja punaiset neliöt edustavat todellisia arvoja, sQ-mallin posteriorisia keskiarvoja ja tQ-mallin posteriorisia keskiarvoja.
Optimaalinen koesuunnittelu tarkkaa ja tehokasta estimointia varten tQ-mallilla
Kun käytetään yhdestä kokeesta saatua etenemiskäyrää, tQ-mallin posterioriset hajontakuviot voidaan luokitella korreloituneeseen tyyppiin (kuvat 4a,b,d,e) ja horisontaaliseen tyyppiin (kuvat 4c,f,g-i). Näiden kahden erityyppisen hajontakuvion leikkauspisteet jakautuvat yleensä kapeasti lähelle todellista arvoa (kuvat 5b ja 6b). Näin ollen kahden tällaisen tietokokonaisuuden yhdistäminen mahdollistaa sekä k catin että K M:n tarkan arvioinnin (kuvat 5a ja 6a). Tarkemmin sanottuna \({E}_{T}\ll {K}_{M}\) ja \({S}_{T}\ll {K}_{M}\) (kuvat 4a,b,d,e) mitattu etenemiskäyrä ja \({S}_{T}\gg {K}_{M}\) tai \({S}_{T}\gg {K}_{M}\) (kuvat 4a,b,d,e). 4c,f,g-i) tarjoavat erityyppistä tietoa parametrien estimointia varten, joten molempien tietokokonaisuuksien käyttö johtaa onnistuneeseen estimointiin. Käytännössä on kuitenkin vaikea verrata S T:n, E T:n ja K M:n arvoja, koska K M:n arvoa ei yleensä tunneta etukäteen. Tämä ongelma voidaan helposti ratkaista käyttämällä hajontakuviota. Toisin sanoen, jos ensimmäisestä kokeesta saatu posteriorinen hajontakuvio on vaakasuora, sekä E T:tä että S T:tä olisi pienennettävä seuraavassa kokeessa, jotta saadaan ei-vaakasuora hajontakuvio (kuva 7a). Toisaalta, jos ensimmäisestä kokeesta saatu hajontakuvio osoittaa vahvaa korrelaatiota K M:n ja k catin välillä, joko S T:tä tai E T:tä olisi suurennettava seuraavassa kokeessa (kuva 7b). Periaatteessa ilman ennakkotietoa K M:n ja k cat:n arvosta nykyisten estimaattien hajontakuvioiden muoto määrittää seuraavan optimaalisen koesuunnitelman, joka takaa tarkan ja täsmällisen estimoinnin. Tätä lähestymistapaa ei kuitenkaan voida käyttää sQ-mallin kanssa, koska sQ-mallilla tapahtuva estimointi voi olla vinoutunutta riippuen E T:n tai S T:n ja K M:n välisestä suhteesta, jota ei tunneta etukäteen. Toisin sanoen, toisin kuin tQ-mallilla, tarkka estimointi ei aina takaa tarkkaa estimointia sQ-mallilla, kuten edellä on nähty (esim. kuva 5a oikealla).
Optimaalinen koesuunnittelu tarkan ja täsmällisen estimoinnin aikaansaamiseksi tQ-mallilla. (a) Kun ensimmäisen kokeen posterioristen näytteiden hajontakuvio on vaakasuora, E T:tä ja S T:tä on pienennettävä, jotta seuraavassa kokeessa saadaan ei-vaakasuora hajontakuvio. Tällöin kahden kokeen yhdistelmän käyttö johtaa tarkkaan ja täsmälliseen estimointiin (punaiset hajontakuviot). (b) Kun ensimmäisen kokeen hajontakuvio ei ole vaakasuora, E T:tä tai S T:tä on suurennettava seuraavassa kokeessa, jotta saadaan vaakasuora hajontakuvio. (c) Yhden etenemiskäyrän päättely matalasta E T:stä (0,1 K M ) ja korkeasta E T:stä (10 K M ) johtaa ei-horisontaalisiin ja horisontaalisiin hajontakuvioihin vastaavasti kymotrypsiinille, ureaasille ja fumaraasille (harmaat hajontakuviot). Kun molempia tietokokonaisuuksia käytettiin yhdessä, saatiin tarkkoja estimaatteja kaikille entsyymeille (punaiset hajontakuviot). Tässä käytetään matalaa S T (0,1 K M ). Tässä vihreät kolmiot edustavat parametrien todellisia arvoja.
Testasimme, voidaanko ehdotetulla lähestymistavalla, jossa käytetään tQ-mallia, arvioida tarkasti k cat- ja K M -arvot kymotrypsiinin, ureaasin ja fumaraasin entsyymeillä tapahtuvalle katalyysille, kun kyseessä on N-asetyyliglysiinietyyliesterin, fumaraatin ja ureaasin katalyysi (kuva 7c). Nämä kolme entsyymiä valittiin, koska niiden katalyyttinen tehokkuus (k cat /K M )1 on erilainen: 0,12, 4 – 105 ja 1,6 – 108 s -1 M -1 . Kullekin entsyymille luotiin 102 kohinaista aikajaksotietosarjaa käyttäen stokastisia simulaatioita, jotka perustuivat tunnettuihin entsyymin kineettisiin parametreihin1. Kun käytetään matalalla E T:llä ja matalalla S T:llä saatuja etenemiskäyriä, saatiin odotetusti kaikille kolmelle entsyymille ei-horisontaalisia jälkimmäisten näytteiden hajontakuvioita (kuva 7c). Tämä osoittaa, että joko E T:tä tai S T:tä olisi lisättävä seuraavassa kokeessa, jotta saataisiin vaakasuora hajontakuvaaja. Kun käytettiin etenemiskäyrää, jossa E T:tä kasvatettiin 100-kertaisesti, saatiin todellakin vaakasuoria hajontakuvioita kaikille entsyymeille (kuva 7c). Kun näitä kahta etenemiskäyrää käytetään yhdessä, sekä k cat että K M voidaan siis arvioida tarkasti (kuva 7c, punaiset pisteet). Nämä tulokset tukevat sitä, että tällainen kaksivaiheinen optimoitu koesuunnittelu (kuvat 7a, 7b) kahden erityyppisen hajontakuvion saamiseksi mahdollistaa entsyymin kinetiikan tarkan ja tehokkaan arvioinnin tQ-mallin avulla. Tällaisen arvioinnin suorittava laskentapaketti on toimitettu (lisätietoja on kohdassa Menetelmä).