John Wilkes Booth hyppää presidentin aitiosta Ford’s Theaterissa ammuttuaan Lincolnin ja puukotettuaan majuri Rathbonea.
Huhtikuun 11. päivänä 1865, kaksi päivää sen jälkeen, kun Lee oli antautunut Appomattoxissa, Lincoln piti puheen, jossa hän esitteli suunnitelmansa rauhasta ja jälleenrakennuksesta. Yleisössä oli John Wilkes Booth, Marylandissa syntynyt ja kasvanut menestynyt näyttelijä. Booth uskoi kiihkeästi orjuuteen ja valkoisten ylivaltaan. Lincolnin sanat kuultuaan hän sanoi seuralaiselleen: ”Nyt, luoja paratkoon, minä pistän hänet hengiltä. Se on viimeinen puhe, jonka hän pitää.”
Epäonnistuttuaan kahdessa aikaisemmassa yrityksessä siepata presidentti, Booth päätti, että Lincoln on tapettava. Hänen salaliittonsa oli suurisuuntainen. Booth ja hänen yhteistyökumppaninsa päättivät salamurhata presidentin, varapresidentti Andrew Johnsonin ja ulkoministeri William Sewardin samana iltana. Lincoln päätti käydä Ford’s Theaterissa katsomassa brittiläistä komediaa Our American Cousin, jonka pääosassa oli kuuluisa näyttelijä Laura Keene. Ulysses S. Grant oli suunnitellut tulevansa presidentin ja hänen vaimonsa mukaan, mutta päivän aikana hän päätti tavata poikansa New Jerseyssä. Näytelmään osallistuivat samana iltana Lincolnien kanssa majuri Henry Rathbone ja hänen morsiamensa Clara Harris, erään merkittävän senaattorin tytär.
Tämä leveäpuoli ilmoittaa presidentti Lincolnin ja ulkoministeri Sewardin salamurhista. Itse asiassa Seward selvisi hyökkäyksestä hengissä.
Keskellä näytelmää samana iltana Booth livahti presidentin aition sisäänkäyntiin pitäen tikaria vasemmassa kädessään ja Derringer-pistoolia oikeassa kädessään. Hän ampui pistoolilla kuuden tuuman päähän Lincolnista ja viilsi Rathbonen kättä veitsellä. Sitten Booth hyppäsi presidentin aition etuosan yli, sai oikean jalkansa kiinni lippuun ja laskeutui lavalle murtaen jalkansa. Hän heilutti tikariaan ja huusi tiettävästi Sic semper tyrannis – latinaksi ”näin olkoon aina tyrannille”. Joidenkin raporttien mukaan hän sanoi: ”Etelä on kostettu”. Sitten hän juoksi ontuen ulos teatterista, hyppäsi hevosensa selkään ja ratsasti kohti Virginiaa.
Luoti osui Lincolnin päähän juuri vasemman korvan taakse, repi aivojen läpi ja juuttui aivan oikean silmän taakse. Vamma oli kuolemaan johtava. Lincoln vietiin läheiseen täysihoitolaan, jossa hän kuoli seuraavana aamuna. Muut kohteet välttyivät kuolemalta. Lewis Powell, yksi Boothin rikoskumppaneista, meni Sewardin taloon, puukotti ja haavoitti vakavasti ulkoministeriä, mutta Seward selvisi hengissä. Toinen rikoskumppani, George Atzerodt, ei jaksanut yrittää salamurhaa varapresidentti Johnsonia.
Kaksi viikkoa myöhemmin, 26. huhtikuuta, unionin ratsuväki vangitsi Boothin virginialaisessa tupakkatallissa. Sotilaat saivat käskyn olla ampumatta ja päättivät polttaa hänet ulos ladosta. Tulipalo sytytettiin. Ennen kuin Booth ehti edes reagoida, kersantti Boston Corbett tähtäsi ja ampui Boothin kuolettavasti. Kuoleva salamurhaaja raahattiin kuistille, jossa hänen viimeiset sanansa lausuttiin: ”Hyödytön … hyödytön!”
Presidentin salamurhaan syyllistyneet salaliittolaiset tuomittiin Hunter-komissioksi kutsutun sotilastuomioistuimen edessä.
Juna kuljetti Lincolnin ruumiin mutkittelevaa reittiä kotiin haudattavaksi Springfieldiin Illinoisin osavaltioon. Sureva kansa saapui satojatuhansittain hyvästelemään presidenttinsä, joka oli ensimmäinen salamurhaajan luodista kaatunut.