Ziele:

1. Zwischen den beiden Hauptkategorien von Bakterien zu unterscheiden: Gram-positiv und Gram-negativ.
2. zu verstehen, wie die Gram-Färbereaktion auf Gram-positive und Gram-negative Bakterien wirkt, basierend auf den biochemischen und strukturellen Unterschieden ihrer Zellwände.

Klicken Sie, um die Animation zu sehen

Färben ist eine Hilfstechnik, die in mikroskopischen Techniken verwendet wird, um die Klarheit des mikroskopischen Bildes zu verbessern.Färbungen und Farbstoffe werden in der Wissenschaft häufig verwendet, um die Struktur biologischer Proben, Zellen, Gewebe usw. hervorzuheben.

Das in der Mikrobiologie am häufigsten verwendete Färbeverfahren ist die Gram-Färbung, die 1884 von dem dänischen Wissenschaftler und Arzt Hans Christian Joachim Gram entdeckt wurde. Bei der Gram-Färbung handelt es sich um eine Differenzialfärbetechnik, die Bakterien in zwei Gruppen unterscheidet: gram-positive und gram-negative. Das Verfahren beruht auf der Fähigkeit der Mikroorganismen, die Farbe der bei der Gram-Färbereaktion verwendeten Farbstoffe zu behalten. Gram-negative Bakterien werden durch den Alkohol entfärbt und verlieren die Farbe des primären Farbstoffs, violett. Gram-positive Bakterien werden durch den Alkohol nicht entfärbt und bleiben violett. Nach dem Entfärbungsschritt wird eine Gegenfärbung verwendet, um den entfärbten gramnegativen Organismen eine rosa Farbe zu verleihen.

Abbildung: Hans Christian Joachim Gram

Bedeutung einer Gram-Färbung:

Die Gram-Färbung ist ein sehr wichtiger erster Schritt bei der anfänglichen Charakterisierung und Klassifizierung von Bakterien. Sie ist auch ein Schlüsselverfahren bei der Identifizierung von Bakterien auf der Grundlage von Färbemerkmalen und ermöglicht die Untersuchung der Bakterien mit einem Lichtmikroskop. Die in einem ungefärbten Ausstrich vorhandenen Bakterien sind unter dem Lichtmikroskop nicht sichtbar. Nach dem Anfärben können auch die Morphologie und die Anordnung der Bakterien beobachtet werden. Darüber hinaus ist sie ein wichtiger Schritt beim Screening von Infektionserregern in klinischen Proben wie z. B. direkten Abstrichen von Patienten.

Das Gram-Färbeverfahren ermöglicht es Bakterien, die Farbe der Färbemittel aufgrund der Unterschiede in den chemischen und physikalischen Eigenschaften der Zellwand zu erhalten.

1. Gram-positive Bakterien: Färben sich dunkelviolett, weil sie den Primärfarbstoff Kristallviolett in der Zellwand einlagern.

Beispiel: Staphylococcus aureus

Abb.: Grampositive Bakterien

2. Gramnegative Bakterien: Sie färben sich rot oder rosa, weil sie den Gegenfarbstoff Safranin zurückhalten.

Beispiel: Escherichia coli

Abb.: Gramnegative Bakterien

Bakterielle Morphologie:

Bakterien sind sehr kleine einzellige Mikroorganismen, die in der Natur allgegenwärtig sind. Sie sind nur wenige Mikrometer (1µm = 10-6 m) groß. Sie haben Zellwände aus Peptidoglykan und vermehren sich durch Zellteilung. Bakterien unterscheiden sich in ihren morphologischen Merkmalen.

Die häufigsten Morphologien sind:

Kokken (pleural: Cocci):

Kugelförmige Bakterien; können paarweise (Diplokokken), in Vierergruppen (Tetrakokken), in traubenartigen Ansammlungen (Staphylokokken), in Ketten (Streptokokken) oder in würfelförmigen Anordnungen von acht oder mehr (Sarkinen) auftreten.

Zum Beispiel: Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes

Bacillus (Pleural: Bacilli):

Stäbchenförmige Bakterien; treten in der Regel einzeln auf, können aber gelegentlich paarweise (Diplo-Bacilli) oder in Ketten (Streptobacilli) vorkommen.

Zum Beispiel: Bacillus cereus, Clostridium tetani

Spirillum (pleural: Spirilla):

Spiralförmige Bakterien

Zum Beispiel: Spirillum-, Vibrio-, Spirocheten-Arten.

Einige Bakterien haben andere Formen wie:

Kokobazillen: Längliche kugelige oder eiförmige Form.

Filamentös: Bazillen, die in langen Ketten oder Fäden vorkommen.

Fusiform: Bazillen mit spitz zulaufenden Enden.

Abb.: Unterschiedliche bakterielle Morphologie

Grammfärbemechanismus:

Gramm positive Zellwand:

Gramm-positive Bakterien haben eine dicke, netzartige Zellwand, die aus Peptidoglykan (50-90% der Zellwand) besteht, das sich violett färbt. Peptidoglykan ist hauptsächlich ein Polysaccharid, das aus zwei Untereinheiten, N-Acetylglucosamin und N-Acetylmuraminsäure, besteht. Bei der Bildung benachbarter Peptidoglykanschichten werden diese mit Hilfe eines Transpeptidase-Enzyms durch kurze Peptidketten vernetzt, wodurch die Form und Steifigkeit der Zellwand entsteht. Die dicke Peptidoglykanschicht von Gram-positiven Organismen ermöglicht es diesen Organismen, den Kristallviolett-Jod-Komplex zu binden und die Zellen violett zu färben.

Lipoteicholsäure (LTA) ist ein weiterer Hauptbestandteil der Zellwand von Gram-positiven Bakterien, der in die Peptidoglykanschicht eingebettet ist. Sie besteht aus Teichoinsäuren, langen Ketten von Ribitolphosphat, die über ein Glycerid in der Lipiddoppelschicht verankert sind. Sie wirkt als Regulator für autolytische Wandenzyme (Muramidasen: Bakterielle Enzyme, die sich in der Zellwand befinden und den Zerfall der Zelle nach einer Verletzung oder dem Tod bewirken)

Medizinische Bedeutung der Gram-positiven Zellwand:

LTA hat auch antigene Eigenschaften, die spezifische Immunreaktionen stimulieren, wenn es nach dem Zelltod aus der Zellwand freigesetzt wird. Der Zelltod ist meist auf die durch lysozymale Aktivitäten, kationische Peptide aus Leukozyten oder Beta-Lactam-Antibiotika induzierte Lyse zurückzuführen.

Grammnegative Zellwand:

Grammnegative Bakterien haben eine dünnere Peptidoglykanschicht (10 % der Zellwand) und verlieren bei der Entfärbung mit der Alkoholspülung den Kristallviolett-Jod-Komplex, behalten aber die Gegenfärbung Safranin, wodurch sie rötlich oder rosa erscheinen. Sie besitzen außerdem eine zusätzliche äußere Membran, die Lipide enthält und durch einen periplasmatischen Raum von der Zellwand getrennt ist.

Medizinische Bedeutung der gramnegativen Zellwand:

Die Zellwand gramnegativer Bakterien ist oft ein Virulenzfaktor, der es pathogenen Bakterien ermöglicht, Krankheiten zu verursachen. Die Virulenz gramnegativer Bakterien wird häufig mit bestimmten Bestandteilen der Zellwand in Verbindung gebracht, insbesondere mit dem Lipopolysaccharid (auch bekannt als LPS oder Endotoxin). Beim Menschen löst LPS eine angeborene Immunreaktion aus, die durch die Produktion von Zytokinen und die Aktivierung des Immunsystems gekennzeichnet ist. Infolge der Zytokinproduktion kommt es zu einer Entzündung, die auch zu einer Toxizität für den Wirt führen kann.

Fleckenreaktion:

Die vier grundlegenden Schritte der Gram-Färbung sind:

1) Auftragen der Primärfärbung Crystal Violet (CV) auf einen hitzefixierten Ausstrich einer Bakterienkultur.

CV dissoziiert in wässrigen Lösungen in CV+ und Cl – Ionen. Diese beiden Ionen dringen dann durch die Zellwand und die Zellmembran sowohl von grampositiven als auch von gramnegativen Zellen. Die CV+-Ionen interagieren später mit negativ geladenen bakteriellen Komponenten und färben die Bakterienzellen violett.

2) Zugabe von Gram’schem Jod.

Jod (I – oder I3 -) wirkt als Beizmittel und als Fänger. Ein Beizmittel ist eine Substanz, die die Affinität der Zellwand für eine Färbung erhöht, indem sie an die Primärfärbung bindet und so einen unlöslichen Komplex bildet, der in der Zellwand eingeschlossen wird. Bei der Gram-Färbereaktion bilden Kristallviolett und Jod einen unlöslichen Komplex (CV-I), der dazu dient, den Ausstrich dunkelviolett zu färben. In diesem Stadium färben sich alle Zellen violett.

3) Entfärbung mit 95%igem Ethylalkohol.

Alkohol oder Aceton löst die äußere Lipidmembran gramnegativer Bakterien auf, wodurch die Peptidoglykanschicht freigelegt wird und die Porosität der Zellwand erhöht wird. Der CV-I-Komplex wird dann von der dünnen Peptidoglykanschicht weggewaschen, so dass gramnegative Bakterien farblos bleiben.

Andererseits hat Alkohol eine austrocknende Wirkung auf die Zellwände von grampositiven Bakterien, wodurch die Poren der Zellwand schrumpfen. Der CV-I-Komplex wird fest in die mehrschichtige, stark vernetzte Gram-positive Zellwand eingebunden und färbt die Zellen violett.

Der Entfärbungsschritt muss sorgfältig durchgeführt werden, da es sonst zu einer Überfärbung kommen kann. Dieser Schritt ist kritisch und muss zeitlich korrekt durchgeführt werden, da sonst die Kristallviolettfärbung von den Gram-positiven Zellen entfernt wird. Wenn das Entfärbungsmittel zu lange auf die Zelle aufgetragen wird, erscheinen die grampositiven Organismen gramnegativ. Eine Unterfärbung tritt auf, wenn der Alkohol nicht lange genug einwirkt, um den CV-I-Komplex aus den gramnegativen Zellen auszuwaschen, so dass die gramnegativen Bakterien grampositiv erscheinen.

4) Gegenfärbung mit Safranin

Die entfärbten gramnegativen Zellen können mit einer geeigneten Gegenfärbung sichtbar gemacht werden, bei der es sich in der Regel um positiv geladenes Safranin handelt, das sie rosa färbt. Die rosa Farbe, die den grampositiven Bakterien anhaftet, wird durch das Violett des Kristallviolets überdeckt (in seltenen Fällen wird anstelle von Safranin auch basisches Fuschin verwendet).