Strains of Streptococcus pyogenes from Schwere invasive Infektionen binden HEp2- und HaCaT-Zellen stärker als Stämme aus unkomplizierten Infektionen

Streptococcus pyogenes (Streptokokken der Gruppe A) ist ein Erreger verschiedener menschlicher Erkrankungen, einschließlich Pharyngitis, Pyodermie und schwerer invasiver Erkrankungen. Darüber hinaus wird der Erreger mit potenziell lebensbedrohlichen Folgeerkrankungen wie poststreptokokkaler Glomerulonephritis und akutem rheumatischem Fieber in Verbindung gebracht. Im australischen Northern Territory (NT) ist die Inzidenz von akutem rheumatischem Fieber unter der einheimischen Bevölkerung sehr hoch (3), obwohl die Isolationsrate von GAS im Hals niedrig ist. Darüber hinaus ist die durch GAS-Infektionen hervorgerufene Pyodermie extrem häufig, und die poststreptokokkale Glomerulonephritis ist in vielen abgelegenen Aborigine-Gemeinden endemisch (4, 7). Während asymptomatische Infektionen des Rachens häufig das gemeldete Reservoir für Stämme darstellen, die mit invasiven Erkrankungen assoziiert sind (5), ist in Bevölkerungsgruppen, in denen Impetigo endemisch ist, wie z. B. in Aborigine-Gemeinschaften in den NT, die Haut das primäre Reservoir. Unabhängig davon, welches Gewebe der primäre Ort der Infektion ist, muss der Erreger zunächst an den Wirtszellen anhaften. Das Genom von S. pyogenes kodiert für zahlreiche Gene, die als Kodierung von Adhäsinen angesehen werden können. Diese Gene sind stark reguliert, und einzelne Stämme haben nicht das genetische Potenzial, für alle diese Proteine zu kodieren. Zu den Adhäsinen gehören das M-Protein (ein antiphagozytisches Molekül), Kapsel- und Fibronektinbindungsproteine. Es gibt viele verschiedene Fibronektin-bindende Proteine, wie SfbI (8, 12), PrtF2 (9, 10), Fbp54 (2) und SfbII (11). Die Adhärenzkapazität eines einzelnen Stammes könnte je nach dem Repertoire der Gene für die Adhäsine, die der Stamm besitzt, und deren Expressionsgrad variieren. Dies wiederum könnte die Unterschiede in der Fähigkeit widerspiegeln, verschiedene Gewebestellen zu besiedeln und dauerhaft zu infizieren. Daraus folgt, dass Isolate von verschiedenen Gewebestellen Unterschiede in der Adhärenzfähigkeit aufweisen können. Um dies zu prüfen, haben wir das Ausmaß der Bindung von GAS-Isolaten aus Haut, Rachen und Blut an HEp2- und HaCaT-Zelllinien bestimmt, die menschliche Kehlkopfepithelzellen bzw. Keratinozyten darstellen.

GAS-Isolate aus dem NT wurden zwischen 1990 und 2002 gesammelt. Die 72 in dieser Studie analysierten Stämme wurden aus Blut (n = 26), Haut (n = 22) und Rachen (n = 24) isoliert (Tabelle 1). Die Blutisolate stammten von schweren Erkrankungen, die übrigen Stämme von unkomplizierten Infektionen. Die Isolate wurden wie zuvor beschrieben typisiert (6). Die Vir-Typisierung erfolgt durch Restriktionsfragmentlängen-Polymorphismus des mga-Regulons, das das Gen für das hochvariable M-Protein enthält. Um sicherzustellen, dass epidemiologisch nicht verwandte Stämme einbezogen wurden, wurde von jedem Vir-Typ ein repräsentatives Isolat einbezogen. Die Kulturen wurden über Nacht bei 37 °C in einem Orbitalschüttler bis zur stationären Phase in Todd-Hewitt-Bouillon (Oxoid, Basingstoke, Vereinigtes Königreich), die mit 1 % Hefeextrakt versetzt war, gezüchtet. Um das GAS-Inokulum für die Adhärenztests vorzubereiten, wurden die Übernachtkulturen zentrifugiert, die Pellets in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS; Life Technologies Gibco BRL, New York, N.Y.) gewaschen und in serum- und antibiotikafreiem RPMI 1640-Medium (Life Technologies) bis zu einer optischen Dichte bei 600 nm von 0,05 resuspendiert. Dies entspricht etwa 1 × 107 bis 1,5 × 107 Bakterien pro ml.

Humane Kehlkopfepithelzellen (HEp2) wurden in RPMI 1640-Medium gehalten, das mit 10 % fetalem Kälberserum (Life Technologies), 1 % Fungizone (Life Technologies), 20 μg Vancomycin HCl (David Bull Laboratories, Sydney, Australien) pro ml und 100 μg Streptomycinsulfat (Sigma, St. Louis, Mo.) pro ml ergänzt wurde. Humane erwachsene Hautkeratinozyten (HaCaT-Zellen) wurden in modifiziertem Dulbecco-Eagle-Medium (Life Technologies) mit 10 % hitzeinaktiviertem fötalem Kälberserum gehalten. Für die Adhärenztests wurden ∼105 Zellen/ml auf Glasdeckgläser mit einem Durchmesser von 12 mm in die Böden von 24-Well-Gewebekulturplatten (Nunc, Roskilde, Dänemark) ausgesät. Nach dem Wachstum über Nacht bei 37 °C in 5 % CO2-Atmosphäre wurden die Zellen mit PBS (pH 7,4) gewaschen und mit 500 μl des GAS-Inokulums beimpft. Nach 2 Stunden Inkubation bei 37 °C wurden die Deckgläser fünfmal gewaschen, indem 1 ml PBS in jede Vertiefung gegeben und die Waschlösung nach vorsichtigem Mischen durch Absaugen entfernt wurde. Nach Entfernung der nicht haftenden Bakterien wurden die Wirtszellen und die haftenden Bakterien mit 95%igem Methanol fixiert und an der Luft getrocknet. Nach der Hitzefixierung wurden die Deckgläser auf Objektträger gelegt und für die Betrachtung unter Ölimmersion Gram-gefärbt. In jedem Experiment wurden Zellen in mehreren zufälligen Feldern analysiert, und die Anheftung wurde als durchschnittliche Anzahl von GAS-Ketten pro Zelle ausgedrückt. Alle Versuche wurden in doppelter Ausführung durchgeführt, und die mittlere Bindung wurde für jeden Stamm bestimmt. Alle statistischen Analysen wurden mit dem Programm Stata Statistics/Data Analysis Version 7.0 (Stata Corporation, College Station, Tex.) durchgeführt. Die Daten wurden mit t-Tests analysiert.

GAS-Stämme hafteten an beiden Zelltypen, und der Grad der Bindung variierte von Stamm zu Stamm (Tabelle 1). Es gab eine gute Korrelation zwischen unabhängigen Experimenten mit 20 Isolaten, die in zwei Zeitintervallen wiederholt wurden (Daten nicht gezeigt), was darauf hindeutet, dass die Avidität der Bindung reproduzierbar und stammspezifisch ist. Insgesamt ist die GAS-Bindung an HaCaT-Zellen größer als an HEp2-Zellen (P < 0,05). Wenn die Daten in Tabelle 1 nach dem Ort der Gewebeisolierung getrennt wurden, banden durchschnittlich 270 Ketten von GAS-Stämmen aus Blut an 50 HaCaT-Zellen (Abb. 1). Im Gegensatz dazu banden Isolate aus Haut und Rachen im Durchschnitt nur 169 bzw. 178 Ketten pro 50 HaCaT-Zellen. Diese Unterschiede sind statistisch signifikant (P = 0,0044 bzw. 0,0063). Interessanterweise sind die Unterschiede bei HEp2-Zellen weniger ausgeprägt und statistisch nicht signifikant. Bei einer erneuten Analyse der Daten auf der Grundlage invasiver bzw. unkomplizierter Infektionen durch Kombination der Daten für die Haut- und Rachenisolate wurden jedoch bei beiden Zelllinien signifikante Unterschiede zwischen den beiden Kategorien festgestellt (P = 0,0011 für HaCaT; P = 0,0238 für HEp2).

Frühere Arbeiten dieses Labors haben gezeigt, dass viele häufig zirkulierende Stämme von S. pyogenes invasive Erkrankungen mit der Haut als primärem Infektionsort verursachen können (1). Diese Beobachtungen stimmen mit den vorliegenden Ergebnissen überein, wonach die NT-GAS-Stämme eine höhere Avidität für HaCaT- als für HEp2-Zelllinien aufweisen und Blutisolate in größerer Zahl binden können als Isolate aus unkomplizierten Infektionen. Mögliche Erklärungen für die hohe Adhärenzneigung von S. pyogenes-Blutisolaten umfassen sowohl genotypische als auch phänotypische Unterschiede zwischen Isolaten aus invasiven und nicht-invasiven Krankheitsquellen. Weitere Studien sind erforderlich, um die Art dieser Bindungsavidität zu definieren und um festzustellen, ob sie innerhalb klonaler Populationen konsistent ist.