Numărul de copii ale O6-metilguanin-ADN metiltransferazei metilate (MGMT) este determinat în raport cu numărul de copii ale beta-actinei (ACTB) prin reacția în lanț a polimerazei specifice metilării în timp real (MSP). Pentru a face acest lucru, conținutul de țesut tumoral este îmbogățit prin microdisecție manuală urmată de extracția ADN. ADN-ul este cuantificat cu ajutorul Picogreen și modificat prin tratament cu bisulfit, care determină transformarea citosinelor nemetilate în uractil, în timp ce citosinele metilate rămân neschimbate. Ulterior, se efectuează o PCR specifică de metilare (MSP) în timp real pe instrumentul Quantstudio 5 pentru a cuantifica numărul de copii ale MGMT și ACTB (1). Această tehnică constă în efectuarea unei PCR cu detecție în timp real cu ajutorul sistemului de detecție Amplifluor. Probele cu un număr necunoscut de copii pot fi cuantificate prin compararea valorilor Ct ale acestora cu cele ale unei curbe standard de plasmidă.
Implicație clinică
MGMT este o enzimă de reparare a ADN-ului care este frecvent dezactivată prin hipermetilare în cancerul uman. Atunci când celulele nu au activitate MGMT, leziunile ADN nu sunt reparate corespunzător, ceea ce face ca un individ să fie mai predispus la dezvoltarea cancerului. Interesant este faptul că această lipsă de activitate MGMT face, de asemenea, ca o celulă tumorală să fie mai sensibilă la radioterapie și la anumite medicamente alchilante, cum ar fi temozolomida (2). În cadrul studiului internațional de validare a prognosticului de fază III (RTOG 0525), testul MGMT a identificat cu succes pacienții cu glioblastom nou diagnosticați care au o probabilitate mai mare de a trăi mai mult și de a avea o perioadă mai lungă de timp fără progresie după tratamentul cu temozolomidă (3-5). Recent, a fost lansată o nouă publicație în care atât pacienții metilați, cât și cei din „zona gri” au avut rezultate semnificativ mai bune în ceea ce privește supraviețuirea generală decât pacienții cu adevărat nemetilați (6).
Specimen Requirements
Specimenele acceptabile pentru analiză sunt specimene de țesut de gliom fixate în formol, încorporate în parafină, cu un timp de fixare de 6-48 de ore.
Volume
Se preferă un bloc de parafină reprezentativ. Alternativ, sunt acceptate 5 secțiuni de țesut necolorate (1 lamelă cu grosimea de 5 µm pentru colorarea H&E și minimum 4 lame cu grosimea de 5-10 µm pentru testarea MGMT).
Instrucțiuni de păstrare și expediere
Mențineți și expediați specimenele la temperatura ambiantă.
Limitări
Pentru unele probe, se va obține un rezultat invalid din cauza unui număr insuficient de copii ACTB în combinație cu un număr de copii MGMT sub limita de detecție. În cea mai mare parte, acest lucru se explică prin cantitatea și/sau calitatea insuficientă de ADN. Pentru eșantioanele nevalabile cu un număr de copii pentru MGMT și/sau ACTB în jurul LOD/LOQ și al pragului de detecție, se recomandă efectuarea unui nou test pornind de la ADN tratat cu bisulfit. Alți fixatori decât formolul sau un timp de fixare prelungit pot da naștere la rezultate necorespunzătoare.
Special Requirements
None
Turn-Around Time
Cinci până la 7 zile lucrătoare pentru lame și, respectiv, blocuri de parafină.
- Vlassenbroeck I et al. Validation of Real-Time Methylation-Specific PCR to determine O6-Methylguanine-DNA Methyltransferase Gene Promotor Methylation in Glioma. J Mol Diagn. 2008 Jul;10(4):332-7
- Hegi ME et al. MGMT gene silencing and benefit from temozolomide in glioblastoma. N Engl J Med 2005 Mar 10;352(10):997-1003.
- Gilbert MR et al. Dose-dense temozolomide for newly diagnosed glioblastoma: a randomized phase III clinical trial.(7). J Clin Oncol. 2013 Nov 10;31(32):4085-91.
- Malmström A et al. Temozolomide versus radioterapie standard de 6 săptămâni versus radioterapie hipofracționată la pacienții cu vârsta peste 60 de ani cu glioblastom: studiul nordic randomizat, faza 3. Lancet Oncol 2012 Sep; 13(9): 916-926.
- Wick W et al. Temozolomida chimioterapie singură versus radioterapie singură pentru astrocitomul malign la vârstnici: studiul randomizat, de fază 3 NOA-08. Lancet Oncol 2012 Jul; 13(7): 707-715.
- Hegi ME et al. MGMT Promoter Methylation Cutoff with Safety Margin for Selecting Glioblastoma Patients into Trials Omitting Temozolomide. A Pooled Analysis of Four Clinical Trials (O analiză combinată a patru studii clinice). Clin Cancer Res 2019 Mar 15 2019; 25(6): 1809-1816.
Updated on 23 May 2019