Tehnici cu anticorpi fluorescenți

De Benedette Cuffari, M.Sc.Revizuit de Emily Henderson, B.Sc.

De la descoperirea sa originală în 1942, colorarea prin imunofluorescență a rămas o tehnică extrem de fiabilă și puternică pentru o gamă largă de scopuri de cercetare și diagnosticare.

Celule leucemice marcate cu molecule fluorescente. Credit imagine: Vshivkova/.com

În general, tehnicile de fluorescență a anticorpilor (FA) vor implica utilizarea celulelor sau a unui anticorp, a cărui regiune constantă a fost marcată cu o etichetă fluorescentă, altfel cunoscută sub numele de fluorofor. Tehnicile FA sunt adesea clasificate ca fiind directe sau indirecte.

Anticorp cu fluorescență directă

Tehnica anticorpului cu fluorescență directă, care poate fi altfel denumită imunofluorescență directă (DIF), implică utilizarea unui singur anticorp primar marcat fluorescent care este folosit pentru a se lega de un antigen țintă. Atunci când este utilizată clinic, DIF este deosebit de utilă pentru diagnosticarea rapidă a bolilor bacteriene, cum ar fi Streptococcus pyogenes, care este mai cunoscut sub numele de streptococ, precum și pneumonia care este rezultatul fie al speciilor Mycoplasma pneumoniae și Legionella pneumophilia.

În astfel de scopuri de diagnosticare, proba pacientului este mai întâi plasată pe o lamă de microscop și apoi expusă la anticorpul fluorescent. Orice legare între anticorpul marcat fluorescent și antigenul țintă, care pentru aceste situații ar fi bacteriile, va face ca aceste substanțe să se lumineze la examinarea cu un microscop cu fluorescență.

În plus față de utilizarea sa ca instrument de diagnosticare, DIF este, de asemenea, utilizat pe scară largă pentru studii de cercetare științifică. În astfel de scopuri, o mostră de țesut congelată care a fost tăiată în secțiuni subțiri de 5 sau 6 micrometri (µm) este plasată pe o lamă de sticlă.

Lămelele sunt apoi incubate cu un anticorp marcat fluorescent, care va include de obicei un panou de anticorpi care sunt direcționați împotriva izotipurilor de anticorpi IgA, IgG și IgM împreună cu complementul 3, care este direcționat împotriva antigenului de interes.

Rețineți că concentrația anticorpului utilizat pentru acest tip de studiu se va baza pe experimentele anterioare care au confirmat ce concentrație poate obține cel mai mare raport semnal/fond.

După ce lamelele au fost incubate timp de cel puțin 30 de minute în întuneric și la temperatura camerei, lamelele sunt spălate și apoi imaginate cu un microscop cu fluorescență.

Creditul imaginii: anyaivanova/.com

Anticorp cu fluorescență indirectă

În comparație cu tehnica într-o singură etapă utilizată pentru DIF, IF indirectă (IIF) sau FA indirectă (IFA) este un proces în doi pași care începe cu aplicarea pe probă a unui anticorp primar nelansat care este îndreptat împotriva unui antigen țintă. A doua etapă a IIF implică utilizarea unui anticorp secundar marcat cu fluorescență care este îndreptat împotriva porțiunii Fc a anticorpului primar.

Deși IIF este considerată mai complicată decât DIF, deoarece durează mai mult și necesită utilizarea a doi anticorpi compatibili, este superioară în ceea ce privește capacitățile sale de sensibilitate.

Câteva aplicații clinice comune ale testelor IFA includ cele utilizate pentru diagnosticarea sifilisului. Pentru acest tip de test IFA, celulele T. palladium care au fost izolate anterior de la un animal de cercetare sunt izolate și plasate pe suprafața unei lamele de sticlă. Un ser care a fost obținut de la un pacient este apoi răspândit peste celulele T. palladium pentru a permite anticorpilor antitreponemici, dacă sunt prezenți, să se lege de antigenele fixate.

După ce proba de ser al pacientului este spălată, se adaugă un anticorp secundar care a fost marcat cu un fluorofor. Un rezultat pozitiv la sifilis va ilumina toate complexele conjugate anticorp secundar-fluorofor.

Un alt tip de IFA care este utilizat pe scară largă în mediul clinic este cel care este folosit pentru diagnosticarea lupusului eritematos sistemic (LES). Pacienții cu LES, care este o boală autoimună, vor avea un nivel crescut de autoanticorpi antinucleari (ANA) circulanți, care sunt îndreptați atât împotriva ADN-ului, cât și a diferitelor proteine care se leagă de ADN.

Pentru acest tip de test IFA, celulele sunt cultivate și apoi plasate pe o lamă de sticlă. Fiecare lamă este apoi incubată cu o concentrație diferită de anticorp al pacientului, care este apoi spălată pentru a elimina orice proteină nelegată.

După etapa de spălare, un anticorp secundar marcat cu fluorescență, care pentru testul ANA va fi anti IgG uman, este adăugat lamelelor și lăsat să se incubeze. Se obține apoi un titru al ANA în ser de la cea mai mare diluție de ser care a prezentat fluorescență și se utilizează pentru a determina un diagnostic de LES.

Citometrie în flux

Cel de-al treilea tip de tehnică cu anticorpi fluorescenți include citometria în flux, care este un sistem automatizat de numărare a celulelor care poate fi utilizat pentru a cuantifica celule specifice care sunt prezente în amestecuri complexe, cum ar fi sângele sau serul.

Un experiment tipic de citometrie în flux va începe cu incubarea unui anticorp marcat fluorescent care este direcționat împotriva unei subpopulații specifice de celule, cum ar fi anti-CD4, care se poate lega de glicoproteina CD4 care se găsește pe suprafața diferitelor celule imune, inclusiv celulele T helper, monocitele și macrofagele. Citometria în flux poate cuantifica, de asemenea, prezența mai multor tipuri de celule prin utilizarea unor producători de celule corespunzători.

După ce incubarea a fost finalizată, proba este apoi introdusă în citometrul în flux. În cadrul acestui aparat, un capilar îngust forțează celulele prezente în cadrul probei să se deplaseze într-un singur rând. Pe măsură ce celulele se deplasează prin capilar, un laser este utilizat pentru a activa și excita orice celule care au fost marcate cu fluoroforul.

Intensitatea fluorescenței fiecărei celule excitate este apoi măsurată de către detectoarele de împrăștiere directă și laterală și reprezentată pe o histogramă pentru analiză. În afară de scopurile de cuantificare, atât citometria în flux, cât și imunofluorescența pot fi utilizate pentru a sorta celulele în subpopulații purificate în scopuri de cercetare printr-o tehnică cunoscută sub numele de sortare celulară activată prin fluorescență (FACS).

• Odell, I. D., & Cook, D. (2013). Tehnici de imunofluorescență. Journal of Investigative Dermatology 133. doi:10.1038/jid.2012.455.
• Parker, N., Schneegurt, M., Tu, A. T., et al. (2016). Capitolul 20.5 Fluorescent Antibody Techniques (Tehnici cu anticorpi fluorescenți). În: In: Microbiology. Accesat din https://openstax.org/books/microbiology/pages/20-5-fluorescent-antibody-techniques.
• Betterle, C., & Zanchetta, R. (2012). Tehnicile de imunofluorescență în diagnosticul bolilor endocrine autoimune. Autoimmunity Highlights 3(2); 67-78. doi:10.1007/s13317-012-0034-3.

Lecturi suplimentare

• Tot conținutul anticorpilor
• VHH Antibodies (Nanobodies) Advantages and Limitations
• Antibody Selection using DNA Origami Scaffolds
• Uses of Histone Deacetylase (HDAC) Antibodies in Research
• Using Antibodies for Parkinson’s Disease Research

Scris de

Benedette Cuffari

După ce a obținut în 2016 diploma de licență în toxicologie cu două specializări în spaniolă și chimie, Benedette și-a continuat studiile pentru a-și finaliza masteratul în Toxicologie în mai 2018. În timpul școlii de absolvire, Benedette a investigat dermatotoxicitatea mecloretaminei și bendamustinei; doi agenți alchilanți de muștar de azot care sunt utilizați în terapia anticancerigenă.

Citate

.