Strains of Streptococcus pyogenes from Severe Invasive Infections Bind HEp2 and HaCaT Cells More Avidly than Strains from Uncomplicated Infections

Streptococcus pyogenes (streptococ de grup A ) este un agent etiologic pentru diverse boli umane, inclusiv faringită, piodermite și boli invazive severe. În plus, agentul patogen este asociat cu sechele potențial amenințătoare de viață, cum ar fi glomerulonefrita poststreptococică și febra reumatismală acută. În Teritoriul de Nord (NT) din Australia, incidența febrei reumatice acute este foarte mare în rândul populației indigene (3), în ciuda unei rate scăzute de izolare a SGA în gât. În plus, piodermia cauzată de infecția cu SGA este extrem de frecventă, iar glomerulonefrita poststreptococică este endemică în multe comunități aborigene izolate (4, 7). În timp ce purtarea asimptomatică în gât este adesea rezervorul raportat pentru tulpinile asociate cu boala invazivă (5), în populațiile în care impetigoul este endemic, cum ar fi în comunitățile aborigene din NT, rezervorul primar este pielea. Indiferent de țesutul care este locul primar al infecției, primul eveniment pe care agentul patogen trebuie să îl realizeze este aderența la celulele gazdei. Genomul S. pyogenes codifică numeroase gene care pot fi considerate ca fiind codificatoare de adezine. Aceste gene sunt puternic reglementate, iar tulpinile individuale nu au potențialul genetic de a codifica toate aceste proteine. Printre adezine se numără proteina M (o moleculă antifagocitară), capsula și proteinele de legare a fibronectinei. Există multe proteine de legare a fibronectinei diferite, cum ar fi SfbI (8, 12), PrtF2 (9, 10), Fbp54 (2) și SfbII (11). Capacitatea de aderență a unei tulpini individuale ar putea varia în funcție de repertoriul de gene pentru adezine pe care le posedă tulpina respectivă și de nivelul de expresie al acestora. Aceasta, la rândul său, poate reflecta diferențele în ceea ce privește capacitatea de a coloniza și de a infecta în mod persistent diferite zone tisulare. Un corolar al acestei afirmații este că izolatele din diferite zone tisulare pot prezenta diferențe în ceea ce privește capacitatea de aderență. Pentru a testa acest lucru, am determinat gradul de aderență a izolatelor GAS din piele, gât și sânge la liniile celulare HEp2 și HaCaT, care reprezintă celulele epiteliale laringiene umane și, respectiv, keratinocitele.

Solatele GAS din NT au fost colectate între 1990 și 2002. Cele 72 de tulpini analizate în acest studiu au fost izolate din sânge (n = 26), piele (n = 22) și gât (n = 24) (tabelul 1). Izolatele din sânge proveneau din boli grave, iar restul tulpinilor proveneau din infecții necomplicate. Izolatele au fost tipizate Vir, așa cum s-a descris anterior (6). Tipizarea Vir implică polimorfismul lungimii fragmentelor de restricție a regulonului mga, care include gena pentru proteina M foarte variabilă. Pentru a asigura includerea tulpinilor fără legătură epidemiologică, a fost inclus un izolat reprezentativ din fiecare tip de virus. Culturile au fost cultivate peste noapte la 37°C într-un agitator orbital până la faza staționară în bulion Todd-Hewitt (Oxoid, Basingstoke, Regatul Unit) suplimentat cu 1% extract de drojdie. Pentru a pregăti inoculul GAS pentru testele de aderență, culturile de peste noapte au fost centrifugate, iar granulele au fost spălate în soluție salină tamponată cu fosfat (PBS; Life Technologies Gibco BRL, New York, N.Y.) și resuspendate în mediu RPMI 1640 fără ser și antibiotice (Life Technologies) până la o densitate optică la 600 nm de 0,05. Aceasta reprezintă aproximativ 1 × 107 până la 1,5 × 107 bacterii pe ml.

Celele epiteliale laringiene umane (HEp2) au fost menținute în mediu RPMI 1640 suplimentat cu 10% ser fetal de vițel (Life Technologies), 1% Fungizone (Life Technologies), 20 μg de vancomicină HCl (David Bull Laboratories, Sydney, Australia) pe ml și 100 μg de sulfat de streptomicină (Sigma, St. Louis, Mo.) pe ml. Keratinocitele de piele umană adultă (celule HaCaT) au fost menținute în mediu Dulbecco’s modified Eagle (Life Technologies) suplimentat cu 10% ser fetal de vițel inactivat termic. Pentru testele de aderență, ∼105 celule/ml au fost însămânțate pe acoperitoare de sticlă cu diametrul de 12 mm în fundul unor plăci de cultură tisulară cu 24 de puțuri (Nunc, Roskilde, Danemarca). După o creștere de o noapte la 37°C într-o atmosferă de 5% CO2, celulele au fost spălate cu PBS (pH 7,4) și inoculate cu 500 μl de inocul de GAS. După 2 h de incubație la 37°C, plăcuțele de acoperire au fost spălate de cinci ori prin adăugarea a 1 ml de PBS în fiecare puț și, după o ușoară amestecare, soluția de spălare a fost eliminată prin aspirare. După îndepărtarea bacteriilor neaderente, celulele gazdă și bacteriile aderente au fost fixate cu metanol 95% și uscate la aer. După fixarea la căldură, lamelele au fost așezate pe lamele și colorate cu Gram pentru a fi vizualizate prin imersie în ulei. În fiecare experiment, au fost analizate celulele din mai multe câmpuri aleatorii, iar atașamentul a fost exprimat ca număr mediu de lanțuri GAS pe celulă. Toate testele au fost efectuate în două exemplare, iar legătura medie a fost determinată pentru fiecare tulpină. Toate analizele statistice au fost efectuate cu programul Stata Statistics/Data Analysis versiunea 7.0 (Stata Corporation, College Station, Tex.). Datele au fost analizate cu ajutorul testelor t.

Sușetele GAS au aderat la ambele tipuri de celule, iar gradul de legare a variat de la o tulpină la alta (tabelul 1). A existat o bună corelație între experimentele independente cu 20 de izolate repetate la două intervale de timp (datele nu sunt prezentate), sugerând că aviditatea de legare este reproductibilă și specifică tulpinii. În general, legarea GAS la celulele HaCaT este mai mare decât la celulele HEp2 (P < 0,05). Atunci când datele din tabelul 1 au fost separate în funcție de locul de izolare a țesutului, o medie de 270 de lanțuri de tulpini GAS din sânge s-au legat la 50 de celule HaCaT (Fig. 1). În schimb, izolatele de piele și gât s-au legat în medie doar 169 și, respectiv, 178 de lanțuri la 50 de celule HaCaT. Aceste diferențe sunt semnificative din punct de vedere statistic (P = 0,0044 și, respectiv, 0,0063). Este interesant faptul că, pentru celulele HEp2, diferențele sunt mai puțin pronunțate și nu sunt semnificative din punct de vedere statistic. Cu toate acestea, atunci când datele au fost reanalizate pe baza infecțiilor invazive versus infecții necomplicate prin combinarea datelor pentru izolatele de piele și de gât, au fost găsite diferențe semnificative între cele două categorii în ambele linii celulare (P = 0,0011 pentru HaCaT; P = 0,0238 pentru HEp2).

Lucrări anterioare ale acestui laborator au arătat că multe tulpini de S. pyogenes care circulă în mod obișnuit ar putea provoca boli invazive cu pielea ca loc primar de infecție (1). Aceste observații sunt în concordanță cu prezentele constatări privind o aviditate mai mare a tulpinilor NT GAS pentru liniile celulare HaCaT decât pentru liniile celulare HEp2, iar izolatele din sânge sunt capabile să se lege în număr mai mare decât izolatele din infecții necomplicate. Posibilele explicații pentru propensiunea ridicată de aderență a izolatelor de S. pyogenes din sânge includ atât diferențe genotipice, cât și fenotipice între izolatele provenite din surse de boli invazive și neinvazive. Sunt necesare studii suplimentare pentru a defini natura acestei avidități de aderență și pentru a determina dacă aceasta este consecventă în cadrul populațiilor clonale.