Reducerea in vivo a RyR1 în mușchi declanșează o miopatie de tip nucleu

Generația RyR1Flox/Flox::HSA-Cre-ERT2 model de șoarece

O linie de șoareci cu situsuri loxP inserate pe ambele părți ale exonilor 9-11 ai genei RYR1 (așa-numita RyR1Flox/Flox) a fost împerecheată cu linia de șoareci HSA-Cre-ERT2 care exprimă recombinaza Cre-ERT2 dependentă de tamoxifen sub controlul genei α-actina a mușchiului scheletic uman , pentru a crea RyR1Flox/Flox::HSA-Cre-ERT2. Injectarea de tamoxifen induce activarea recombinazei Cre-ERT2 în mod selectiv în mușchiul scheletic, ceea ce duce la deleția exonilor 9-11 și la întreruperea genei RYR1 în mușchiul scheletic cu o dependență strictă de tamoxifen (Fig. 1a). La naștere, șoarecii RyR1Flox/Flox::HSA-Cre-ERT2 au fost normali, iar la vârsta de 2 luni, odată ajunși adulți tineri, recombinarea a fost indusă prin injectarea de tamoxifen (din acest moment, animalele recombinate au fost numite RyR1-Rec). Consecințele moleculare și fiziologice au fost studiate în continuare în funcție de timp, până la 105 zile după inducerea recombinării (Fig. 1b). Animalele de control (CTRL) sunt animale de rând RyR1Flox/Flox (fără transgenul HSA-Cre-ERT2) injectate cu tamoxifen. Fenotipul general al șoarecilor recombinați la 75 de zile este caracterizat de o cifoză asociată cu o mobilitate anormală a membrelor posterioare și cu un mers dârz. Animalele sunt încă capabile să se ridice pe picioarele din spate pentru a se hrăni, dar peletele de hrană au fost administrate sistematic direct în cușcă pe măsură ce boala a progresat. La 105 zile, animalele sunt încă mobile în cuștile lor și nu s-a observat o creștere a ratei de mortalitate în comparație cu CTRL. Au fost afectați atât masculi, cât și femele. Cantitatea relativă de RyR1 la nivel de ARNm a fost analizată în mușchiul cvadriceps la fiecare 15 zile după recombinare cu ajutorul RT-q-PCR la animalele CTRL și la animalele RyR1-Rec (Fig. 1c). S-a observat o scădere rapidă a RyR1 mRNA, cu un nivel scăzut și stabil de 21% ± 4% din valoarea inițială, atins imediat după 3 zile de la injectarea de tamoxifen. O reducere a fost observată în toți mușchii testați la 75 de zile după inducerea recombinării (cvadriceps, tibialis anterior, EDL, soleus, Fișier suplimentar 1: Fig. S1A). Cantitatea de proteină RyR1 a fost analizată în continuare, utilizând Western blot cantitativ în omogenatele musculare de cvadriceps (Fig. 1d, e). Această cantitate a fost redusă progresiv și a ajuns la aproximativ 50% din valoarea inițială după 105 zile. Nu a fost observată nicio reducere suplimentară a proteinei RyR1 la perioade mai lungi (datele nu sunt prezentate). Cantitatea de proteină RyR1 a fost cuantificată în diferite omogenate musculare la 75 de zile după recombinare. O reducere a fost observată în toți mușchii analizați, deși cantitatea rămasă a fost ușor diferită între mușchi, cea mai mare fiind în interosoasă (64% ± 5%) și cea mai mică în soleus (33% ± 5%) (Fișier suplimentar 1: Fig. S1B).

Șoarecii RyR1-Rec prezintă o reducere progresivă a greutății musculare și corporale și a forței musculare

Consecințele reducerii RyR1 au fost studiate mai întâi la nivelul întregului animal. Inițial la aceeași greutate, animalele CTRL au crescut încet în greutate de la 24,4 ± 0,4 la 30,6 ± 0,8 g la D90, în timp ce animalele RyR1-Rec au pierdut progresiv în greutate până la 20,6 ± 1,3 g la D90 (Fig. 2a). Atât masculii, cât și femelele au fost afectați și au pierdut aproximativ 13 % din greutatea corporală inițială după 75 de zile (Fișier suplimentar 1: Fig. S1C). Acesta este rezultatul unei pierderi de greutate observate în toți mușchii (Fișier suplimentar 1: Fig. S1D). Pentru a testa performanța musculară generală după reducerea RyR1, animalele au fost supuse la două teste de rezistență diferite. Mai întâi li s-a permis să atârne apucând o suprafață cu fire încrucișate cu toate cele patru labe până la 5 min, latența la cădere reflectând forța musculară. Testul de prindere efectuat în fiecare săptămână pe parcursul a 105 zile (Fig. 2b) a arătat că animalele RyR1-Rec au început să își piardă forța la 20-30 de zile după injectarea de tamoxifen, când cantitatea de RyR1 era de aproximativ 75-80% din valoarea sa inițială, și au fost incapabile să se agațe de grilă la aproximativ 75 de zile după injectarea de tamoxifen, deoarece cantitatea de RyR1 a ajuns la nivelul de aproximativ 60%. Forța musculară a fost, de asemenea, evaluată printr-un protocol de electrostimulare neinvazivă de 6 minute a mușchiului gastrocnemius, cuplat la imagistica prin rezonanță magnetică (IRM) anatomică sub anestezie generală. În timpul protocolului de electrostimulare a animalelor CTRL la 30 de zile după injectarea de tamoxifen (Fig. 2c, D30) s-a înregistrat un profil tipic de exerciții, cu o forță musculară inițială stabilă care a scăzut lent pe măsură ce mușchiul a obosit. În grupul CTRL, la D60 și D90, profilul de exerciții a arătat o îmbunătățire a forței musculare atunci când animalele au îmbătrânit (Fig. 2c). În schimb, performanța animalelor RyR1-Rec, similară cu cea a CTRL la D30, s-a deteriorat odată cu vârsta. Animalele RyR1-Rec nu au mai putut efectua exercițiul la D90 (Fig. 2c, RyR1-Rec D90). Volumul gastrocnemius măsurat cu ajutorul imaginilor RMN (Fig. 2d) a rămas stabil la animalele CTRL de la D30 (161 ± 5 mm3) la D90 (164 ± 4 mm3). În schimb, la șoarecii RyR1-Rec, volumul gastrocnemius a fost semnificativ mai mic decât la șoarecii CTRL de la D30 (141 ± 3 mm3, p = 0,003), și a fost redus în continuare până la 100 ± 3 mm3 la D60 (p < 0,001 în comparație cu CTRL la aceeași vârstă) și 69 ± 4 mm3 la D90 (p < 0,001 în comparație cu CTRL la aceeași vârstă). Tensiunea de contracție specifică maximă (tensiunea de contracție absolută normalizată la volumul muscular) confirmă faptul că ambele grupuri au prezentat o forță musculară similară la D30 (Fig. 2e), dar forța animalelor RyR1-Rec a scăzut dramatic, în timp ce a crescut la animalele CTRL pe măsură ce au înaintat în vârstă. În plus, modificările bioenergeticii mușchiului gastrocnemius în timpul electrostimulării au fost evaluate în mod noninvaziv la D60, utilizând spectroscopia RMN in vivo cu 31-fosfor (31P). În timp ce pH-ul intramiofibrilar bazal nu a fost diferit între cele două grupuri (Fișier suplimentar 1: Fig. S2A), gradul de acidoză la sfârșitul exercițiului a fost mai mic (p = 0,016) la animalele RyR1 Rec (Fișier suplimentar 1: Fig. S2B), sugerând astfel că fluxul glicolitic în mușchiul care face exerciții a fost redus la aceste animale. Mai mult, constanta de timp a resintezei fosfocreatinei post-exercițiu (τPCr) a fost semnificativ mai scurtă (p = 0,047) la șoarecii RyR1-Rec (Fișier suplimentar 1: Fig. S2C, D), reflectând o funcție mitocondrială îmbunătățită in vivo. Într-adevăr, sinteza PCr în timpul perioadei de recuperare post-exercițiu se bazează exclusiv pe sinteza oxidativă a ATP, astfel τPCr este considerat ca un indice al capacității de fosforilare oxidativă . În general, aceste rezultate indică faptul că reducerea progresivă a RyR1 este asociată cu o pierdere progresivă a greutății și o scădere a forței musculare.

Proprietățile fiziologice ale fibrelor izolate sunt compromise la șoarecii RyR1-Rec

Alterarea funcției musculare a fost caracterizată în continuare la nivelul fibrei musculare unice folosind o combinație de clampare de tensiune cu celule întregi și imagistică confocală . Rețeaua de tubuli T a fost imaginată prin colorarea membranei plasmatice cu di-8-anepps. Nu a fost observată nicio diferență calitativă în rețea (Fig. 3a, stânga) sau diferență cantitativă în densitatea medie a tubulilor T între fibrele CTRL și RyR1-Rec, pe lângă o scurtare ușoară, dar semnificativă a lungimii medii a sarcomerelor în repaus (Fig. 3a, graficele din dreapta). Afluxul de Ca2+ activat de tensiune prin DHPR (Fig. 3b-d) și al fluxului de eliberare de Ca2+ prin RyR1 (Fig. 3e-i) au fost evaluate simultan. În comparație cu fibrele CTRL, fibrele RyR1-Rec au prezentat curenți de Ca2+ activați de voltaj în DHPR cu un curs de timp similar (Fig. 3b), dar cu o densitate redusă, așa cum arată densitatea maximă a curentului în funcție de voltaj în cele două grupuri (Fig. 3c), ceea ce s-a tradus printr-o reducere cu 30% a conductanței maxime (Gmax), fără nicio modificare asociată a celorlalți parametri ai relației curent vs. voltaj (Fig. 3d). Dependența de voltaj a eliberării de Ca2+ SR a fost evaluată din imagistica cu scanare de linie a colorantului rhod-2 sensibil la Ca2+. Imaginile line-scan de la fibrele RyR1-Rec au fost calitativ similare cu cele de la fibrele CTRL (Fig. 3e), prezentând o creștere rapidă a fluorescenței la depolarizarea membranei tubului T, omogenă din punct de vedere spațial de-a lungul liniei scanate. Rata de eliberare a SR Ca2+ (Fig. 3g), calculată din modificările fluorescenței rhod-2 provocate de impulsuri de depolarizare de amplitudine crescândă (Fig. 3f), a prezentat o evoluție în timp similară în fibrele RyR1-Rec ca și în fibrele CTRL, dar, important, valorile de vârf au fost reduse în RyR1-Rec. Ajustarea ratei maxime de eliberare a SR Ca2+ în funcție de tensiune (Fig. 3h-graficul de sus) a indicat că rata maximă de eliberare a Ca2+ a fost redusă cu 25% în grupul RyR1-Rec (Fig. 3i, Max), factorul de pantă (k) a fost, de asemenea, ușor, dar semnificativ redus, în timp ce tensiunea de la mijlocul activării (V0,5) a rămas neschimbată. A fost observată o creștere ușoară (1,3 ms în medie), dar semnificativă a timpului până la viteza maximă de eliberare a SR Ca2+ în fibrele RyR1-Rec (Fig. 3h, graficul de jos). Nu au fost observate modificări în capacitățile de eliminare a Ca2+ citosolic al fibrelor (funcția de pompare SERCA), măsurată cu colorantul sensibil la Ca2+ de joasă afinitate fluo-4 FF în condiții de ne-egta-tamponare (Fișier suplimentar 1: Fig. S3). În general, aceste rezultate demonstrează că reducerea cu 35% a cantității de RyR1 în interosoasă este asociată cu o reducere cu 30% a curentului de calciu prin DHPR și o reducere cu 25% a fluxului de calciu prin RyR1.

Reducerea RyR1 afectează structura mușchiului scheletic

Pentru a înțelege mai bine bazele acestor modificări funcționale asociate cu o scădere a RyR1, structura musculară a fost studiată la animalele RyR1-Rec la D75 după recombinare, și comparată cu cea a animalelor CTRL. Extensor digitorum longus (EDL), un mușchi cu contracție rapidă, soleus, un mușchi cu contracție lentă și tibialis anterior (TA), un mușchi mixt, au fost analizate cu ajutorul colorațiilor cu hematoxilină-eozină, NADH și tricromie Gomori. Colorațiile din TA, prezentate în Fig. 4a, arată o structură musculară anormală la animalele RyR1-Rec, fără fibroză sau nuclei centrali, dar cu atrofie a fibrelor, afectând atât fibrele de tip I, cât și cele de tip II (Tabelul 2). O dezorganizare a mitocondriilor, caracterizată prin acumulare locală / epuizare în regiunile adiacente ale aceleiași fibre (cap de săgeată și inset Fig. 4a) și o acumulare de colorare roșie observată cu tricromul Gomori (Fișier suplimentar 1: Fig. S4) a fost, de asemenea, observată, semănând cu nucleele prăfuite descrise recent la pacienți . Atrofia fibrelor a fost observată în ambele tipuri de fibre în EDL, deși reducerea a fost ușor mai importantă în fibrele de tip I (Tabelul 2). Secțiunea transversală TA a șoarecilor CTRL și RyR1-Rec a fost colorată cu anticorpi împotriva RyR1 și desmin. Nu s-a observat nicio modificare în distribuția RyR1 între fibrele de tip I și tip II în secțiunile TA RyR1-Rec, ceea ce indică o reducere similară a RyR1 în toate tipurile de fibre (Fig. 4b). În mod surprinzător, s-a observat o modificare importantă în distribuția desminei, cu o creștere uriașă în fibrele mici de tip I (Fig. 4b): în secțiunile CTRL TA, toate fibrele au prezentat o colorare periferică similară, în timp ce fibrele mici de tip I din secțiunile RyR1-Rec TA au fost puternic colorate atât la periferia fibrelor, cât și în citosol (inset Fig. 4b). Deși marcarea IF nu este cantitativă, aceste rezultate arată că reducerea RyR1 a fost cel mai probabil omogenă, fără diferențe uriașe între fibrele adiacente, așa cum s-a observat pentru desmină, cuantificarea realizată prin Western blot fiind reflectarea proteinei conținute în fiecare fibră și nu o medie a fibrelor cu 0% RyR1 și a fibrelor cu 100% RyR1 din cadrul aceluiași mușchi.

Organizarea triadelor a fost studiată în continuare cu ajutorul marcării prin imunofluorescență a fibrelor EDL izolate (Fig. 5a). Marcarea alfa-actininei (ca marker al liniei Z), a triadinei și a RyR1 (ca markeri ai triadelor) pe fibra EDL RyR1-Rec a demonstrat că reducerea cantității de RyR1 a dus la o dezorganizare generalizată a fibrei cu o localizare anormală a triadelor și întreruperea liniei Z, dar triadina și RyR1 erau încă parțial colocalizate. Deși triadele au rămas pe ambele părți ale liniei Z, linia Z nu a format o linie dreaptă ca în CTRL și, în schimb, a prezentat multe microdisrupții (inset Fig. 5a). Ultrastructura musculară a fost analizată cu ajutorul microscopiei electronice pe fibrele RyR1-Rec EDL la D75 (Fig. 5b). Unele regiuni aveau o structură relativ conservată (Fig. 5b, fibra din stânga), în timp ce unele regiuni adiacente erau foarte dezorganizate, cu întreruperea organizării regulate a sarcomerelor, dezorganizarea mitocondriilor și prezența a numeroase grămezi de membrane (Fig. 5b, săgeți, mărite în inserție), numite anterior triade multiple . Caracteristicile morfologice ale acestor triade multiple în comparație cu triadele simple normale sunt prezentate în tabelul 3, iar exemple suplimentare sunt prezentate în fișierul suplimentar 1: Fig. S5. Cuantificarea precisă a lățimii putative a tubului T, a lățimii putative a SR și a spațiului intermembranar (tubul T/SR) (Fișier suplimentar 1: Fig. S5) a demonstrat o creștere uriașă a dimensiunii medii a tubului T în acele triade multiple (creștere de două ori, ajungând la 202% din dimensiunea tubului T în triada normală), în timp ce lățimea medie a SR a fost doar ușor crescută (+ 10%), iar spațiul intermembranar nu a fost modificat. Aceste rezultate indică o dezorganizare structurală generalizată a mușchilor șoarecilor RyR1-Rec asociată cu remodelarea membranelor.

Reducerea RyR1 este asociată cu modificarea cantității a numeroase proteine

Consecințele reducerii RyR1 au fost studiate la nivel molecular prin Western blot cantitativ pe mușchiul cvadriceps al CTRL sau RyR1-șoareci Rec (8 animale în fiecare grup) la D75 după injectarea de tamoxifen (Fig. 6). Cantitatea relativă a numeroase proteine implicate direct sau indirect în manipularea calciului a fost estimată, folosind ca referință cantitatea totală de proteine determinată prin evaluarea fără colorare . Nu s-a observat nicio diferență în ceea ce privește cuantificarea RyR1 între această metodă și utilizarea lanțului greu al miozinei ca proteină de referință (comparație între Fig. 1, 6). Nu s-a observat nicio modificare semnificativă între mușchii CRTL și RyR1-Rec în ceea ce privește cantitatea de izoformă T95 a triadinei, proteina de legare a calciului CSQ1, Ca2+-ATPasa SERCA, FoF1-ATPasa mitocondrială și subunitatea alfa 1 a DHPR (Fig. 6a, b). În schimb, a fost observată o creștere a cantității de STIM1 (× 3,7 ± 1, p = 0,02), a izoformei triadinei T51 (× 1,6 ± 0,1, p < 0,001), a CLIMP63 (× 1,8 ± 0,2, p = 0,004) și a ORAI1 (× 3,7 ± 1, p = 0,017). Deoarece a fost observată modificarea localizării proteinei structurale desmin cu ajutorul marcării prin imunofluorescență (Fig. 5b), a fost cuantificat, de asemenea, nivelul de expresie a desminei și a fost observată o creștere uriașă a cantității de desmină (× 8,2 ± 1,2, p = 0,001). Localizarea CLIMP63 și STIM1 în fibrele RyR1-Rec EDL a fost analizată utilizând etichetarea imunofluorescentă și nu s-a observat nicio modificare majoră (Fișier suplimentar 1: Fig. S6). Prin urmare, reducerea proteinei RyR1 a fost asociată cu o creștere a diferitelor proteine implicate în reglarea calciului sau în arhitectura musculară.

Autofagia este alterată ca urmare a reducerii RyR1

Alterarea autofagiei a fost observată în unele miopatii . Pentru a identifica mecanismele care conduc la atrofia musculară consecutivă reducerii RyR1, am căutat modificări ale fluxului de autofagie în mușchii RyR1-Rec. Cantitatea de LC3 II, o proteină de membrană a autofagozomilor, a fost evaluată prin Western blot cantitativ (Fig. 7a, b), și s-a observat o creștere a LC3 II (172% ± 32%, p = 0,03). Această creștere a autofagozomilor ar putea reflecta fie o creștere a formării autofagozomilor (datorită unei creșteri a procesului de autofagie), fie o scădere a fuziunii acestora cu lizozomii (și, prin urmare, o inhibare a degradării autofagiei). Natura precisă a modificării fluxului de autofagie a fost analizată în continuare prin cuantificarea p62, o proteină bine cunoscută, degradată în mod specific prin autofagie, a cărei cantitate a fost, de asemenea, semnificativ crescută (Fig. 7a, b, 172% ± 22%, p = 0,006). Creșterea asociată a LC3 II și a p62 în mușchiul RyR1-Rec comparativ cu controlul a sugerat că reducerea RyR1 a fost, prin urmare, asociată cu inhibarea fluxului de autofagie. Mai mult, a fost observată o creștere a activării (fosforilare) a doi inhibitori ai autofagiei, mTOR și proteina S6 (Fig. 7b, c), (P-mTOR/mTOR creștere cu 174% ± 17%, p = 0,01; P-S6/S6 creștere cu 320% ± 50%, p < 0,001). Creșterea fosforilării acestor doi inhibitori ai autofagiei la animalele RyR1-Rec în comparație cu cele de control a indicat și mai mult spre o inhibiție a autofagiei responsabilă de atrofia musculară la animalele RyR1-Rec.

Biopsiile pacienților umani prezintă defecte similare cu cele observate la șoarecii RyR1-Rec

Într-un studiu recent pe o cohortă mare de pacienți cu o miopatie congenitală recesivă , am identificat prezența unor structuri atipice, numite „nuclee prăfuite”, la mai mult de jumătate dintre pacienții cu o reducere a cantității de RyR1. Acestea au fost observate prin colorare multiplă și diferă de nucleul central clasic (regiuni bine definite lipsite de colorare oxidativă) prin marginile lor slab definite, dezorganizarea miofibrilară focală, o depunere de material granular roșiatic-violet la colorarea cu tricromul Gomori și o zonă amestecată cu activitate enzimatică scăzută sau/și crescută la colorarea oxidativă (Fișier suplimentar 1: Fig. S7). Aceste modificări structurale reflectă modificările observate în modelul nostru de șoarece (Fig. 4 și Fișierul suplimentar 1: Fig. S7). Prin urmare, am comparat în continuare noul nostru model de șoarece și biopsiile musculare de la pacienții cu o reducere a proteinei RyR1 și „nuclee prăfuite”. Folosind Western blot cantitativ, cantitatea de proteine care au fost modificate în mod clar în modelul nostru de șoarece a fost, de asemenea, estimată la 5 pacienți cu o boală recesivă Dusty Core (două mutații RyR1 care au dus la reducerea proteinei RyR1-Fig. 8a). Biopsii de control de vârste diferite (între 3,5 și 64 de ani) au fost folosite ca referință. O reducere mare a proteinei RyR1 a fost observată la toți pacienții (nivel mediu de expresie 19,8% ± 2,2% din CTRL, p < 0,001). În plus, s-a observat, de asemenea, o creștere a CLIMP63 și a desminei. Reducerea RyR1 a fost asociată cu o creștere importantă a CLIMP 63 (creșterea medie a nivelului de expresie de cinci ori, 516% ± 220%). În plus, nivelul de expresie al desminei a fost, de asemenea, drastic crescut la pacienți în comparație cu controlul (creșterea medie a nivelului de expresie de 240 de ori, 24 170% ± 7 635%). Folosind microscopia electronică pentru a analiza ultrastructura biopsiei pacienților, au fost observate multe stive de membrane în regiunile dezorganizate (Fig. 8c, săgeți) la toți pacienții. Aceste regiuni, similare cu grămezile observate în mușchiul RyR1-Rec (Fig. 4b), au indicat un mecanism comun, atât la șoareci, cât și la om, care a dus la formarea acestor structuri ca urmare a reducerii RyR1. Cu modificări identice cu cele de la pacienții cu boala Dusty Core, acest model constituie astfel un model relevant pentru studierea mecanismelor fiziopatologice.

.