Materiale și metode
Participanți
Subiecții au fost 83 de copii cu ADHD (75% băieți) și 72 de copii cu TD (51% băieți), cu vârste cuprinse între 6 și 13 ani. Criteriile de includere pentru grupul ADHD au fost: (a) un diagnostic clinic de ADHD în conformitate cu criteriile DSM-IV, (b) confirmarea acestui diagnostic prin programul de interviu de diagnostic pentru copii, ediția a patra, administrat părinților (DISC-IV-P; ), (c) simptome semnificative de ADHD, indicate prin evaluări ale părinților >90 percentila a 90-a pe cel puțin una dintre scalele ADHD (scalele de neatenție și hiperactivitate/impulsivitate) ale Scalei de evaluare a tulburărilor de comportament disruptiv (DBDRS; ), și (d) simptome de ADHD pervazive, indicate prin evaluări ale profesorilor >75 percentila a 75-a pe cel puțin una dintre scalele ADHD ale DBDRS. Faptul de a avea un diagnostic comorbid (de exemplu, ODD sau ASD) nu a fost un criteriu de excludere și nici tratamentul cu medicamente stimulante. Copiii care iau medicamente stimulante (N = 50, 60% din grupul ADHD) au întrerupt consumul de medicamente cu 24 de ore înainte de testare, pentru a permite o spălare completă , și în timpul participării la studiul nostru. Criteriile de includere pentru grupul TD au fost: (a) absența unui diagnostic clinic al oricărei tulburări de dezvoltare sau comportamentale (inclusiv ADHD și ODD) și (b) scoruri <90 percentila a 90-a pe ambele scale ADHD evaluate de părinți și de profesori ale DBDRS.
Materiale
Comportament.
Părinții copiilor eligibili pentru includerea în grupul ADHD au fost evaluați cu secțiunea de tulburare de comportament disruptiv a DISC-IV-P. DISC-IV-P este un interviu de diagnostic standardizat utilizat pe scară largă pentru evaluarea tulburărilor psihiatrice ale copilăriei din DSM-IV, cu proprietăți psihometrice adecvate.
Părinții și profesorii copiilor din grupul ADHD și TD au completat DBDRS pentru a evalua simptomele ADHD și simptomele ODD și CD. DBDRS conține patru scale care măsoară simptomele de neatenție, hiperactivitate/impulsivitate, ODD și CD pe o scară Likert în 4 puncte (de la 0 la 3), scorurile mai mari indicând simptome mai grave. Au fost raportate proprietăți psihometrice adecvate pentru DBDRS .
Scala de evaluare a simptomelor ADHD și a comportamentului normal (SWAN; ) a fost completată de părinți și profesori pentru a evalua simptomele ADHD. Acest chestionar utilizat pe scară largă conține două subscale; scala de neatenție și scala de hiperactivitate/impulsivitate, fiecare cuprinzând 9 itemi. Itemii sunt punctați pe o scală Likert de 7 puncte (de la -3 la +3), scorurile mai mari indicând simptome mai grave. Itemii se bazează pe simptomele DSM-IV ale ADHD, dar reflectă ambele capete (puternic și slab) ale comportamentului descris în fiecare simptom ADHD. Scorurile medii la ambele subscale au fost utilizate ca variabile dependente. Proprietăți psihometrice adecvate au fost raportate pentru SWAN .
Simptomele ADHD au fost evaluate cu ajutorul Scalei de receptivitate socială (SRS; ) cu 65 de itemi, completată de părinți și profesori. Itemii SRS se bazează pe domeniile simptomelor DSM-IV ale TSA, inclusiv afectarea interacțiunii sociale, deficitele de comunicare și modelele restrânse/stereotipice de comportamente sau interese. SRS utilizează o scală Likert în 4 puncte (de la 0 la 3), iar scorul însumat al itemilor pe scala totală SRS a fost utilizat ca măsură dependentă, scorurile mai mari indicând simptome mai grave. SRS are proprietăți psihometrice adecvate.
Pete de sânge.
Pentru a investiga concentrațiile sanguine de triptofan, tirozină și fenilalanină, a fost utilizată tehnica petelor de sânge uscate. Recoltarea petelor de sânge este mai puțin invazivă pentru copii decât prelevarea de probe de sânge venos, iar tehnica petelor de sânge uscate este suficient de robustă și stabilă pentru scopuri diagnostice . Concentrațiile de AAA din spoturile de sânge sunt foarte bine corelate cu concentrațiile serice de AAA (rs variind de la 0,86 la 0,96) . O pată de sânge de la fiecare copil a fost colectată cu ajutorul unei lănțițe de siguranță de unică folosință. Trei picături de sânge au fost aplicate pe o cartelă de colorare a sângelui. O puncție de 5,5 mm dintr-o pată de sânge uscată a fost amestecată cu 100 μl de soluție de standard intern (care conține 29 μM L-fenilalanină-D5, 6 μM L-tirozină-D4 și 5 μM L-triptofan-D5) și 400 μl de metanol într-un flacon de cromatografie în fază gazoasă (GC-vial) și a fost agitată timp de 15 minute într-o baie cu ultrasunete. Supernatantul a fost transferat într-un alt GC-vial și evaporat sub azot la 30°C. Ulterior, proba a fost butilată cu 100 μl de clorură de acetil 5,5% (în n-butanol) la 60°C timp de 15 minute. După aceea, stratul de butanol a fost evaporat sub azot (la 30°C), iar reziduul a fost dizolvat în 500μl de acetonitril. Concentrațiile de triptofan, tirozină și fenilalanină din spotul de sânge au fost determinate prin cromatografie lichidă cu electrospray pozitiv-spectrometrie de masă în tandem (LC-MS/MS), utilizând un spectrometru de masă API 3000 cu triplu cuadripol (Applied Biosystems, Foster City, CA, SUA), cuplat la un sistem de cromatografie lichidă de înaltă performanță (HPLC) (Perkin Elmer Series 200, Shelton, SUA). Trei μl de probă au fost injectați pe o coloană C18 simetrică (3,9*150 mm, 5μm; Waters, Milford, MA, SUA) și eluată cu un debit de 1 ml/min de acetonitril 75% (conținând 0,4% de acid formic). Triptofanul, tirozina și fenilalanina s-au eluat în decurs de 1 minut și au fost măsurate cu ajutorul tranzițiilor: raportul masă-încărcare (m/z) 261,2→159,2 (triptofan), m/z 238,2→136,2 (tirozină) și m/z 222,2→120,2 (fenilalanină). Toate datele LC-MS/MS obținute au fost achiziționate și prelucrate cu ajutorul software-ului Analyst 1.4.2 (Applied Biosystems, Foster City, CA, SUA). Concentrațiile de triptofan, tirozină și fenilalanină din spotul de sânge au fost exprimate în μmole/L. Fiabilitatea LC-MS/MS a fost confirmată prin examinarea variației între teste (fiind de 5-10%), a variației în interiorul testului (fiind de 8-10%) și a recuperării (fiind de 90-112%).
Ingestia zilnică de proteine.
Ingestia zilnică de proteine a fost evaluată pe parcursul a trei zile, folosind un jurnal nutrițional raportat de părinți. Au fost furnizate înregistrări și instrucțiuni dietetice standardizate. Părinții au fost instruiți să înregistreze toate alimentele și băuturile consumate în registrul dietetic și să exprime cantitățile consumate cât mai exact posibil. Cantitatea de aport proteic (grame/zi) a fost calculată pe baza unei versiuni computerizate a bazei de date olandeze privind compoziția alimentelor . Baza de date olandeză privind compoziția alimentelor conține peste 2000 de produse alimentare cu informații despre compoziția nutrițională a acestor produse alimentare . Baza de date este utilizată pe scară largă în scopuri științifice (de exemplu).
Urină.
Pentru a examina concentrațiile urinare de AAA, participanții au colectat toată urina excretată în decurs de 18 ore consecutive (după orele de școală) într-un recipient de colectare a urinei. În timpul colectării urinei, recipientul a fost depozitat într-un frigider (<5°C). O probă de 10 ml a fost trimisă la un laborator pentru analiză, unde proba a fost păstrată la -20°C. Pentru analiza triptofanului din urină s-a utilizat o tehnică HPLC cu detecție prin fluorescență . Concentrațiile de tirozină și fenilalanină în urină au fost determinate cu ajutorul unui analizor de aminoacizi Biochrom . Concentrațiile urinare de triptofan, tirozină și fenilalanină au fost exprimate printr-un raport μmole la volumul total de urină, pentru a exclude efectele poliuriei sau oliguriei. Fiabilitatea tehnicii HPLC a fost confirmată prin examinarea preciziei analizelor, fiind de 2,25 % pentru triptofan (abatere standard relativă) și de 1,50 % pentru tirozină și fenilalanină. Există corelații ridicate între concentrațiile de aminoacizi din probele de 12 ore și probele de 24 de ore , ceea ce indică faptul că nu există o variație diurnă în excreția de aminoacizi, validând utilizarea unei probe de 18 ore în studiul actual.
Procedură
Acest studiu a primit aprobarea comitetului local de etică medicală al Centrului Medical al Universității VU din Amsterdam, Țările de Jos (#NL39922.029.12), și a fost efectuat în conformitate cu standardele etice stabilite în Declarația de la Helsinki din 1964 și modificările ulterioare ale acesteia. Consimțământul în cunoștință de cauză scris a fost obținut de la părinții tuturor copiilor, precum și de la copiii ≥12 ani, înainte de participare. Copiii cu ADHD au fost recrutați din clinicile ambulatorii de sănătate mintală, prin intermediul asociației de părinți pentru copiii cu probleme de comportament și prin intermediul unui site de cercetare al universității. Grupul TD a fost recrutat din școlile primare situate pe întreg teritoriul țării. Copiii care luau medicamente stimulente au întrerupt consumul de medicamente cu o zi înainte de participare (ziua 0), pentru a asigura o spălare completă, și în timpul evaluării sângelui, a urinei și a aportului alimentar (de la ziua 1 la ziua 3). În ziua 1, pata de sânge a fost recoltată dimineața devreme, pentru a exclude efectele variației diurne a concentrațiilor de AAA în sânge. În aceeași zi, după ora de școală, a început colectarea de urină, care a continuat în următoarele 18 ore, până când copilul urma să se întoarcă la școală în dimineața următoare (ziua 2). În dimineața devreme a zilei 1, părinții au primit instrucțiuni detaliate cu privire la modul de completare a fișei dietetice și la modul de colectare a urinei copilului lor. După instructaj, părinții au început să înregistreze aportul alimentar al copilului lor, care a continuat în următoarele trei zile (ziua 1 până în ziua 3). Părinții și profesorii au fost invitați să completeze chestionarele pe un site web securizat. Toate datele au fost colectate între februarie 2013 și iulie 2014. Grupul ADHD și grupul TD au fost recrutați simultan, pentru a controla posibilele efecte sezoniere asupra aportului alimentar sau a metabolismului AAA.
Analiza datelor
Toate analizele statistice au fost efectuate utilizând R, versiunea 3.2.1. Toate variabilele au fost inspectate cu privire la valorile aberante și valorile lipsă pentru grupul ADHD și TD separat. Winsorising a fost aplicat la valorile aberante, acestea au fost înlocuite cu o valoare cu o unitate mai mare (sau mai mică) decât scorul anterior cel mai extrem din distribuția grupului . Datele lipsă în ceea ce privește concentrațiile urinare, datele alimentare și datele comportamentale au fost distribuite aleatoriu și înlocuite folosind mediile grupului. În cazul punctelor de sânge nu au existat date lipsă. Toate datele au fost distribuite în mod normal, cu excepția simptomelor CD. Diferențele de grup în ceea ce privește sexul au fost examinate folosind un test chi pătrat, iar diferențele de grup în ceea ce privește vârsta și funcționarea comportamentală au fost examinate folosind teste t pe eșantioane independente.
Pentru a testa prima ipoteză, diferențele de grup în concentrațiile de pete de sânge AAA au fost evaluate folosind Analize ale Varianțelor (ANOVA) cu grupul (ADHD sau TD) ca factor fix. Dimensiunile efectului au fost calculate în termeni de eta pătrat parțial și interpretate ca fiind mici (>.01), medii (>.06) sau mari (>.14) . În plus, au fost calculate odds ratios, care au exprimat riscul de a fi diagnosticat cu ADHD cu concentrații de AAA sub medie. Datele normative pentru concentrațiile AAA au fost obținute dintr-un eșantion mare de copii cu vârste cuprinse între 6 și 13 ani (N = 104, 52% bărbați) (date nepublicate, informații despre eșantion și rezultate disponibile de la autori). Pentru fiecare AAA, concentrațiile corespunzătoare celei mai mici percentilă 16 (M-1 SD) din eșantionul normativ au fost utilizate ca valoare de prag pentru a defini concentrațiile AAA sub medie (pentru triptofan 45 μmole/L, tirozină 39 μmole/L și fenilalanină 47 μmole/L). Odds ratios au fost calculate cu intervalul lor de încredere de 95% și s-a efectuat testul exact Fisher pentru a examina semnificația odds ratios.
Pentru a testa cea de-a doua ipoteză, coeficienții de corelație produs-moment Pearson au investigat relația dintre concentrațiile AAA din spotul de sânge și simptomele de ADHD evaluate de părinți și de profesori. Magnitudinea coeficienților de corelație a fost interpretată ca fiind mică (>.10), medie (>.30) sau mare (>.50) . Datele grupului ADHD și ale grupului TD au fost combinate pentru a maximiza variabilitatea în măsurătorile simptomelor ADHD.
Pentru a testa cea de-a treia ipoteză, au fost efectuate analize de corelație între concentrațiile de AAA din spotul de sânge și ingestia de proteine și concentrațiile de AAA urinare în întregul eșantion. De asemenea, am examinat dacă au existat diferențe de grup în ceea ce privește ingestia de proteine și concentrațiile de AAA urinare folosind ANOVA cu grupul (ADHD sau TD) ca factor fix. În cele din urmă, analizele corelaționale au evaluat dacă concentrațiile de AAA din spotul de sânge au fost legate de simptomele raportate de părinți și profesori ale tulburărilor psihiatrice comorbide (coeficienții de corelație produs-moment Pearson pentru ODD și TSA, coeficienții de corelație de rang Spearman pentru CD). În cazul în care s-a constatat că simptomele de ODD, CD sau ASD au fost legate de concentrațiile de AAA, analizele anterioare au fost reluate cu aceste simptome introduse ca și covariate. Pentru a corecta testele multiple, nivelul alfa al analizelor de corelație a fost ajustat în conformitate cu procedura Bonferroni pentru fiecare domeniu de rezultat; simptome ADHD (12 analize, deci p = 0,004), potențiali determinanți ai anomaliilor AAA în petele de sânge (12 analize, deci p = 0,004) și simptome de tulburări psihiatrice comorbide (18 analize, deci p = 0,003). Sunt raportate rezultatele ajustate cu Bonferroni.
.