Obiective:

1. Să diferențieze între cele două mari categorii de bacterii: Gram pozitive și Gram negative.
2. Să înțeleagă modul în care reacția de colorare Gram afectează bacteriile Gram pozitive și Gram negative, pe baza diferențelor biochimice și structurale ale pereților lor celulari.

Click pentru a vedea animația

Răspunderea este o tehnică auxiliară utilizată în tehnicile microscopice folosită pentru a spori claritatea imaginii microscopice.Colorațiile și coloranții sunt utilizate pe scară largă în domeniul științific pentru a evidenția structura specimenelor biologice, a celulelor, țesuturilor etc.

Cel mai utilizat procedeu de colorare în microbiologie este colorația Gram, descoperită de omul de știință și medicul danez Hans Christian Joachim Gram în 1884. Colorația Gram este o tehnică de colorare diferențială care diferențiază bacteriile în două grupe: gram-pozitive și gram-negative. Procedura se bazează pe capacitatea microorganismelor de a reține culoarea coloranților utilizați în timpul reacției de colorare Gram. Bacteriile gram-negative sunt decolorate de alcool, pierzând culoarea colorantului primar, violet. Bacteriile Gram-pozitive nu sunt decolorate de alcool și vor rămâne de culoare purpurie. După etapa de decolorare, se folosește o contracolorație pentru a conferi o culoare roz organismelor gram-negative decolorate.

Fig: Hans Christian Joachim Gram

Importanța unei colorații Gram:

Colorația Gram este o etapă preliminară foarte importantă în caracterizarea și clasificarea inițială a bacteriilor. Este, de asemenea, o procedură cheie în identificarea bacteriilor pe baza caracteristicilor de colorare, permițând examinarea bacteriilor cu ajutorul unui microscop optic. Bacteriile prezente într-un frotiu necolorat sunt invizibile atunci când sunt observate cu ajutorul unui microscop optic. Odată colorată, se poate observa și morfologia și dispunerea bacteriilor. În plus, este, de asemenea, o etapă importantă în depistarea agenților infecțioși în probele clinice, cum ar fi frotiurile directe de la un pacient.

Procedura de colorare Gram permite bacteriilor să rețină culoarea coloranților, pe baza diferențelor dintre proprietățile chimice și fizice ale peretelui celular.

1. Bacteriile Gram pozitive: Se colorează violet închis datorită reținerii în peretele celular a colorantului primar numit Crystal Violet.

Exemplu: Staphylococcus aureus

Fig: Bacterii Gram pozitive

2. Bacterii Gram negative: Se colorează în roșu sau roz datorită reținerii colorantului de contracolorare numit Safranin.

Exemplu: Escherichia coli

Fig: Bacterii Gram negative

Morfologia bacteriană:

Bacteriile sunt microorganisme unicelulare foarte mici, omniprezente în natură. Ele au dimensiuni de ordinul micrometrilor (1µm = 10-6 m). Ele au pereți celulari compuși din peptidoglican și se reproduc prin fisiune binară. Bacteriile variază în ceea ce privește caracteristicile lor morfologice.

Cele mai frecvente morfologii sunt:

Coccus (pleural: Cocci):

Bacterii sferice; pot apărea în perechi (diplococi), în grupuri de patru (tetracocci), în ciorchini asemănători strugurilor (stafilococi), în lanțuri (streptococi) sau în aranjamente cubice de opt sau mai multe (sarcinae).

De exemplu: Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes

Bacillus (pleural: Bacilli):

Bacterii în formă de bastonaș; în general apar singure, dar ocazional se pot găsi în perechi (diplo-bacili) sau în lanțuri (streptobacili).

De exemplu: Bacillus cereus, Clostridium tetani

Spirillum (pleural: Spirilla):

Bacterii în formă de spirală

De exemplu: Spirillum, Vibrio, specii de spirochete.

Câteva bacterii au și alte forme, cum ar fi:

Coccobacili: Formă sferică sau ovoidală alungită.

Filamentoasă: Bacili care se prezintă în lanțuri sau fire lungi.

Fusiformă: Bacili cu capetele conice.

Fig: Diferite morfologii bacteriene

Mecanism de colorație a gramului:

Gramă pozitivă pentru peretele celular:

Bacteriile Gram-pozitive au un perete celular gros ca o plasă care este alcătuit din peptidoglican (50-90% din peretele celular), care se colorează în violet. Peptidoglicanul este în principal o polizaharidă compusă din două subunități numite N-acetilglucozamină și acid N-acetil muramic. Pe măsură ce se formează straturi adiacente de peptidoglican, acestea sunt legate între ele prin lanțuri scurte de peptide cu ajutorul unei enzime transpeptidaze, ceea ce determină forma și rigiditatea peretelui celular. Stratul gros de peptidoglican al organismelor Gram-pozitive permite acestor organisme să rețină complexul cristal violet-iod și colorează celulele ca fiind purpurii.

Acidul lipoteichoic (LTA) este un alt constituent major al peretelui celular al bacteriilor Gram-pozitive care este încorporat în stratul de peptidoglican. Este alcătuit din acizi teicoici care sunt lanțuri lungi de fosfat de ribitol ancorate la bistratul lipidic prin intermediul unei gliceride. Acționează ca regulator al enzimelor autolitice de perete (muramidaze: Enzime bacteriene localizate în peretele celular care provoacă dezintegrarea celulei în urma unei leziuni sau a morții)

Relevanța medicală a peretelui celular Gram pozitiv:

LTA are, de asemenea, proprietăți antigenice care stimulează răspunsurile imune specifice atunci când este eliberată din peretele celular după moartea celulei. Moartea celulară se datorează mailn general lizei induse de activități lizozomiale, peptide cationice din leucocite sau antibiotice beta-lactame.

Peretele celular Gram negativ:

Bacteriile Gram negativ au un strat mai subțire de peptidoglican (10% din peretele celular) și pierd complexul cristal violet-iod în timpul decolorării cu clătirea cu alcool, dar păstrează contracolorantul Safranin, apărând astfel roșiatice sau roz. De asemenea, au o membrană externă suplimentară care conține lipide, care este separată de peretele celular prin intermediul spațiului periplasmic.

Relevanța medicală a peretelui celular Gram negativ:

Peretele celular al bacteriilor Gram negative este adesea un factor de virulență care permite bacteriilor patogene să provoace boli. Virulența bacteriilor Gram-negative este adesea asociată cu anumite componente ale peretelui celular, în special lipopolizaharida ( cunoscută și sub numele de LPS sau endotoxină). La om, LPS declanșează un răspuns imunitar înnăscut caracterizat prin producerea de citokine și activarea sistemului imunitar. Inflamația apare ca urmare a producției de citokine, care poate produce, de asemenea, toxicitate pentru gazdă.

Reacția de pătare:

Cele patru etape de bază ale colorației Gram sunt:

1) Aplicarea colorantului primar Crystal Violet (CV) pe un frotiu de cultură bacteriană fixat termic.

CV se disociază în soluții apoase în ioni CV+ și Cl -. Acești doi ioni pătrund apoi prin peretele celular și membrana celulară atât a celulelor Gram-pozitive, cât și a celor Gram-negative. Ulterior, ionii CV+ interacționează cu componentele bacteriene încărcate negativ și colorează celulele bacteriene în violet.

2) Adăugarea de iod Gram.

Iodul (I – sau I3 -) acționează ca un mordant și ca un agent de captare. Un mordant este o substanță care mărește afinitatea peretelui celular pentru un colorant, legându-se de colorantul primar, formând astfel un complex insolubil care rămâne prins în peretele celular. În reacția de colorare Gram, violetul de cristal și iodul formează un complex insolubil (CV-I) care are rolul de a da frotiului o culoare violet închis. În acest stadiu, toate celulele vor deveni purpurii.

3) Decolorarea cu alcool etilic 95%.

Alcoolul sau acetona dizolvă membrana externă lipidică a bacteriilor Gram negative, lăsând astfel stratul de peptidoglican expus și crește porozitatea peretelui celular. Complexul CV-I este apoi spălat de stratul subțire de peptidoglican, lăsând bacteriile Gram negative incolore.

Pe de altă parte, alcoolul are un efect de deshidratare asupra pereților celulari ai bacteriilor Gram pozitive, ceea ce face ca porii peretelui celular să se micșoreze. Complexul CV-I se leagă strâns în peretele celular Gram pozitiv multistratificat și puternic reticulat, colorând astfel celulele în violet.

Etapa de decolorare trebuie efectuată cu atenție, altfel se poate produce o supradecolorare. Această etapă este critică și trebuie cronometrată corect, în caz contrar colorația cu cristal violet va fi îndepărtată de pe celulele Gram-pozitive. Dacă agentul de decolorare este aplicat pe celulă pentru un timp prea îndelungat , organismele Gram-pozitive să apară Gram-negative. Subdecolorarea apare atunci când alcoolul nu este lăsat să acționeze suficient de mult timp pentru a spăla complexul CV-I de pe celulele Gram-negative, ceea ce face ca bacteriile Gram-negative să pară Gram-pozitive.

4) Contracolorarea cu safranină

Celulele Gram-negative decolorate pot fi făcute vizibile cu o contracolorație adecvată, care este de obicei safranina încărcată pozitiv, care le colorează în roz. Culoarea roz care aderă la bacteriile Gram pozitive este mascată de violetul cristalului violet (în situații rare, în locul safraninei se folosește uneori fuschinul de bază).

.