Mecanismul de depolimerizare sinergică a capătului ascuțit al filamentului de actină de către proteina asociată cu ciclaza și cofilina

Constructe ADN

Toate proteinele N-CAP de șoarece, N-CAP-GFP, CAP1 complet, domeniul HFD, domeniul HFD, fuziunea GST a domeniului HFD și domeniul C-terminal ADF-H al twinfilinei, au fost clonate în vectorul de expresie bacteriană pSUMOck4 (un cadou amabil de la Inari Kursula, Universitatea din Bergen, Norvegia) pentru a exprima o proteină de fuziune marcată SUMO care lasă un N-terminal nativ după clivarea cu proteaza SENP2. Pentru construcțiile de domeniu CARP și C-CAP, am utilizat vectorul de expresie bacteriană pCoofy18 (un cadou amabil de la Addgene). Pentru detalii privind construcțiile proteice și primerii utilizați pentru clonarea construcțiilor, a se vedea tabelul suplimentar 2.

Exprimarea și purificarea proteinelor CAP și a fragmentelor sale

Toate proteinele CAP de șoarece și fragmentele sale, cu excepția CAP1 de lungime completă, au fost exprimate la +22 °C în mediu LB de autoinducție (AIMLB0210, Formedium) timp de 24 h în BL21(DE3) E. coli (de la Novagen).

CAP1 de șoarece cu lungime completă a fost exprimată în mediu LB folosind celule E. coli ArcticExpress (DE3). Mai întâi, am inoculat o cultură starter care conține kanamicină (20 µg/ml) și gentamicină (20 µg/ml) care a fost incubată timp de 6 h la +37 °C. Cultura principală de 3,6 l, care conține doar kanamicină (20 µg/ml), a fost inoculată și a crescut până la o DO600 de ~0,4 la +37 °C, agitându-se la 240 rpm. Temperatura de cultură a fost schimbată la +13 °C timp de 1 h înainte de exprimarea proteinei, care a fost indusă prin adăugarea de 0,26 mM IPTG timp de 46 h. Toate peletele bacteriene au fost colectate prin centrifugare, resuspendate în 50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 25 mM imidazol, pH 7,5, congelate instantaneu cu N2 lichid și depozitate la -80 °C.

Toate proteinele CAP și domeniul ADF-H al twinfilinei au fost purificate folosind un flux de lucru similar. În primul rând, bacteriile au fost lizate prin sonicare în prezența de lizozimă (0,5 mg/ml), ADNză (0,1 mg/ml) și inhibitori de protează (200 µg/ml PMSF, 1 µg/ml leupeptină, 1 µg/ml aprotinină, 1 µg/ml pepstatină A; toate de la Sigma-Aldrich), iar lizatul a fost clarificat prin centrifugare. Supernatantul a fost încărcat într-o coloană HisTrap HP Ni-NTA de 1 ml (GE Healthcare) și a fost spălat abundent (>20 volume de coloană) cu 50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 25 mM imidazol, pH 7,5. Proteinele au fost eluate cu un gradient de 25-250 mM imidazol pe aparatul AKTA Pure (GE Healthcare). Fracțiile de vârf au fost grupate și s-a adăugat protează SENP2 la o concentrație finală de 40 µg/ml pentru îndepărtarea SUMO-tag. Amestecul a fost dializat O/N la 4 °C folosind tubulatura de dializă SnakeSkin în 1 l de soluție tampon 20 mM HEPES, 300 mM NaCl, 2 mM DTT, pH 7,4. A doua zi, SUMO-tag-urile scindate au fost îndepărtate cu bile de agaroză Ni-NTA (Qiagen) în cazurile în care SUMO-tag-ul și proteina scindată aveau dimensiuni egale. Proteinele au fost concentrate cu un filtru centrifugal Amicon Ultra-4 de 10 kDa (Merck) și încărcate în coloana de filtrare pe gel HiLoad 16/600 Superdex 200 (GE Healthcare) echilibrată în 5 mM HEPES, 100 mM NaCl, 1 mM DTT, pH 7,4. Fracțiunile de vârf au fost colectate, concentrate și congelate prin congelare rapidă în N2 pentru a fi depozitate la -80 °C.

CAP de lungime completă a fost purificat cu următoarele excepții. Am utilizat o coloană HisTrap HP Ni-NTA de 5 ml în loc de o coloană de 1 ml. După dializă și filtrare pe gel cu coloana de filtrare pe gel HiLoad 16/60 Superdex 200, fracțiunile cu vârfuri majore au fost trecute prin coloana de filtrare pe gel Superose 6 increase 10/300 GL pentru a obține o mai bună separare a amestecului de stări oligomerice. În cele din urmă, vârfurile majore din mai multe serii au fost combinate, concentrate la intervale de rotație de 5 minute cu ajutorul unui filtru centrifugal Amicon Ultra-4 30 kDa și stocate ca mai sus. Proteinele CARP și C-CAP au fost purificate ca mai sus, cu excepția utilizării proteazei 3C (0,01 mg/ml) pentru scindarea etichetei.

Alte proteine

Actina musculară de iepure, actinele marcate, profilina, cofilina-1 de șoarece, proteina de captare și biotina-gelsolina au fost preparate așa cum se descrie în ref. 16. ADP-actina a fost preparată conform descrierii din ref. 34. Pe scurt, o soluție de 30 µM ATP-G-actină care conține 0,3 mM glucoză și 1 unitate/ml de hexokinază (Sigma) a fost dializată cu un tampon de schimb de nucleotide (5 mM Tris-HCl, 0,1 mM MgCl2, 0,05 mM EGTA, 0,2 mM ADP, 1 mM DTT, pH 8,0) timp de 4 ore la 4 °C. Toate experimentele au fost efectuate folosind α-actina din mușchi de iepure.

Sesizări de depolimerizare a capătului ascuțit al actinei

Măsurarea vitezei de depolimerizare a capătului ascuțit al filamentului de actină a fost efectuată folosind un dispozitiv microfluidic cuplat la o instalație de microscopie, așa cum este descris16. Pe scurt, am pregătit o cameră cu polidimetil siloxan (PDMS, Sylgard), care a fost montată pe o lamelă de acoperire curățată. Camerele microfluidice aveau o înălțime de 20 µm. Cele trei intrări și ieșirea au fost conectate la tuburi cu presiune controlată umplute cu soluții de diferite compoziții biochimice (dispozitiv microfluidic Fluigent).

După montare, camerele au fost clătite cu dH20 și F-buffer (5 mM HEPES pH 7,4, 100 mM KCl, 1 mM MgCl2, 0,2 mM EGTA, 0,4 mM CaCl2, 0,2 mM ATP, 10 mM DTT și 1 mM DABCO). Camera a fost apoi expusă succesiv la: 150 µl de 0,1% biotină-BSA în tampon F; 300 µl de 5% BSA; 150 µl de 3 µg/ml neutravidină în tampon F; și 10-100 µl de 1-3 pM biotină-gelsolină. Înainte de experimente, filamentele de actină au fost polimerizate (8 µM, >30 min) în tampon F. O fracțiune de monomeri de actină a fost marcată cu Alexa-488 sau 568. Filamentele au fost în cele din urmă injectate în cameră și ancorate pe lamela de acoperire de către gelsoline până la densitatea dorită.

Pentru a măsura rata de depolimerizare a capetelor ascuțite decorate cu cofilină, filamentele au fost mai întâi saturate cu 2 µM de cofilină și expuse la 2 µM de cofilină suplimentată cu diferite proteine CAP. Rata de depolimerizare a fost analizată cu ImageJ, realizând mai întâi o kimografie pentru fiecare filament (funcție reslice) și ajustând manual o pantă de-a lungul capătului ascuțit. Filamentele ale căror capete ascuțite nu au putut fi urmărite în mod clar sau care au avut posibile pauze (ne)observate53 sau evenimente de secționare au fost eliminate din analiză.

Pentru a minimiza efectul etichetării proteinei asupra măsurătorilor noastre, am folosit fie 10%, fie 16% fracție de etichetare a actinei, în funcție de configurația microscopică. Nu am observat efecte ale fracției de etichetare pentru activitatea N-CAP în experimentele noastre. Toate experimentele au fost efectuate la temperatura camerei, într-o configurație fără control al temperaturii.

Reanalizarea filamentelor de actină

Soluțiile de F-actină preformată, în stare de echilibru (în tampon F) cu diferite etichete fluorescente au fost amestecate și incubate pentru a cuantifica reanalizarea. Soluția amestecată conținea 4 µM de Alexa568-actină (10% marcată) și 4 µM de Alexa488-actină (10% marcată), cu sau fără N-CAP și mutanți. După 4 minute la temperatura camerei, soluția mixtă de F-actină a fost diluată 100× în soluție tampon suplimentată cu 0,2% metilceluloză și a fost transferată într-o cameră deschisă realizată cu bandă dublu adezivă intercalată între două lamele de acoperire și pasivată cu BSA. Seriile de imagini (interval de 2 s) au fost achiziționate în cel puțin trei câmpuri de vedere diferite. S-a numărat numărul de segmente de F-actină verde (Alexa488), precum și numărul acestor segmente care erau conectate la un segment de F-actină roșie (Alexa568), pentru a determina raportul dintre cele două segmente de culoare reprezentate în Fig. 2f. Monitorizarea difuziei filamentelor ne-a permis să determinăm fără ambiguitate când două segmente au fost conectate. Controalele (fără N-CAP în amestecul de F-actină) au fost repetate de mai multe ori, iar experimentele (cu N-CAP sau mutanți) de cel puțin două ori.

Sesizări de secționare a actinei

Pentru a investiga impactul N-CAP asupra secționării de către cofilină, am folosit două metode diferite, fie (1) prin măsurarea fracțiunii de domenii unice de cofilină care nu au dus încă la o secționare, fie prin (2) cuantificarea numărului global de evenimente de secționare pe µm de filament de actină.

(1) Secționarea asociată cu domenii unice de cofilină (Fig. suplimentară 3c). Am urmat procedura descrisă anterior16. Pe scurt, în interiorul unei camere microfluidice, au fost polimerizate 12% filamente de actină marcate cu Alexa-488 din semințe de spectrină-actină, ancorate nespecific pe o lamelă de acoperire pasivată cu BSA. Filamentele au fost îmbătrânite timp de 15 minute cu o soluție de G-actină la concentrația critică (100 nM G-actină), astfel încât filamentele să devină >99% ADP46. Filamentele au fost apoi expuse în mod continuu la 500 nM mCherry-cofilin-1 singur, cu 2 µM CAP1 de lungime completă sau cu 10 µM N-CAP. Pe ImageJ, au fost apoi construite kimograme ale filamentelor pentru a urmări nuclearea și asamblarea domeniilor individuale de cofilină și evenimentele de separare la interfața cu segmentele de actină goală.

Pentru fiecare domeniu, timpul 0 a fost definit la cadrul pe care acestea s-au nucleat. Apoi am înregistrat fie momentul în care au indus un eveniment de separare, fie momentul în care sunt pierdute din cauza separării de către un alt domeniu, a fuziunii sau a unui eveniment de cenzură. Fracțiunea de domenii care nu au indus un eveniment de separare a fost apoi calculată folosind o metodă clasică Kaplan-Meier.

(2) Numărul total de evenimente de separare/µm (Fig. suplimentară 3d). În interiorul camerelor de curgere (între două lamele de acoperire distanțate cu bandă dublu-adezivă, am injectat mai întâi filamente prepolimerizate marcate cu Alexa-488 (în tampon F, cu 0,2-0,3% metilceluloză). Soluția a fost apoi schimbată cu 500 nM cofilin-1 neetichetat și 0, 1 sau 10 µM NCAP. După schimb, filamentele care au rămas lângă suprafață au fost analizate după cum urmează.

Numărul de evenimente de rupere pe µm a fost calculat ca funcție cumulativă

unde Nsev(u) este numărul de evenimente de separare la momentul u, iar \(\mathop {\sum}\nolimits_i {l_{i(u)}}}\) este suma tuturor filamentelor i a lungimii lor la momentul u. Deoarece soluția nu conține G-actină, filamentele se depolimerizează, iar lungimea filamentelor scade astfel în timp.

Legăturarea N-CAP la capetele ascuțite ale filamentelor

Experimentul a fost realizat în camere de curgere (a se vedea testul de separare a actinei (2)), pasivate cu biotină-PLL-PEG și funcționalizate cu neutravidină. F-actina (10% Alexa-568, 1% biotină) a fost polimerizată peste noapte la 4 µM. Chiar înainte de injectarea în cameră, F-actina a fost diluată până la 200 nM și amestecată cu 100 nM N-CAP-GFP, 2 µM cofilin-1 și 4 nM proteină de captare, în tampon F suplimentat cu 0,2% metilceluloză. Imaginile filamentelor de actină au fost achiziționate înainte și după o achiziție în flux a canalului GFP (5 cadre/secundă timp de 12 s, microscopie TIRF). Pentru analiza legării la capetele filamentelor, au fost selectate în orb filamentele de actină care nu s-au mișcat în timpul achiziției fluxului. Fluorescența a fost măsurată la cele două capete ale fiecărui filament, pe o suprafață de 3 pe 3 pixeli. Un eveniment de legare a fost detectat atunci când fluorescența depășea un prag arbitrar (aceeași valoare pentru toate filamentele și capetele filamentelor). Deoarece proteina de capsulare ar trebui să protejeze capătul bărbos, capătul ascuțit a fost atribuit celui cu cele mai multe evenimente de legare. N-CAP-GFP a fost detectată în 17 % din punctele de date la capătul ascuțit al filamentului, în timp ce asocierea nespecifică a N-CAP-GFP în apropierea capătului bărbos al filamentului a fost detectată în 1,7 % din punctele de date. Fracția de supraviețuire a N-CAP la capătul ascuțit a fost apoi calculată și ajustată cu o exponențială simplă pentru a măsura rata de nelegare.

Cristalizarea și determinarea structurii

Domeniul HFD de șoarece a fost cristalizat cu 10×His-tag prezent și purificat așa cum a fost descris mai sus, cu excepția utilizării în filtrarea pe gel a unui tampon 5 mM HEPES, 50 mM NaCl, 0,2 mM DTT, 0,01% NaN3, pH 7,5. Proba a fost concentrată la 7-10 mg/ml înainte de cristalizare și a fost amestecată 1:1 cu cacodilat de sodiu 0,1 M, 12% PEG4000 (p/v), pH 6,1, utilizând o metodă de picătură așezată, cu o dimensiune a picăturii de 200 nl în format 96 de puțuri. După 2 săptămâni de incubare au fost observate cristale mari sub formă de ace. Pentru colectarea de date de la distanță la Diamond Light Source (Marea Britanie, Didgot), la linia de fascicule I03, cristalele au fost crioprotejate prin înmuiere în lichidul mamă care conține 25% glicerol și au fost congelate rapid în N2 pentru a fi trimise la linia de fascicule. Datele au fost colectate la 100 K folosind lungimea de undă de 0,9763 Å, detectorul Pilatus3 6M, o putere de transmisie de 30%, o expunere de 0,05 s și un unghi de oscilație de 0,1° ca un total de 2400 de cadre. Datele de difracție au fost integrate și scalate cu X-ray Detector Software (XDS)54. Soluția inițială a fost obținută cu înlocuire moleculară utilizând PHASER55 și PDB = 1s0p ca model de căutare. A fost găsită o soluție cu patru domenii HFD prezente într-o unitate asimetrică, după care mai multe runde de rafinare cu BUSTER56 și construirea manuală în COOT57 au dus la o bună potrivire cu datele (a se vedea tabelul 1). O îmbunătățire suplimentară a fost obținută prin rafinarea datelor cu introducerea parametrilor de translație-liberare-înșurubare (1/lanț), eliminarea restricțiilor necristalografice și modelarea factorilor B atomici individuali. Rezultatul final Rwork/Rfree pentru model a fost de 18,6%/23,0% cu o geometrie generală bună.

Pentru cristalizarea complexului tripartit (din ADP-actina, domeniul HFD al CAP1 de șoarece și domeniul C-terminal ADF-H al twinfilinei-1 de șoarece), ADP-actina a fost preparată în dializă O/N la +4 °C în 5 mM HEPES, 0.2 mM MgCl2, 0,2 mM ADP, 0,2 mM EGTA, 0,3 mM glucoză, 0,5 mM β-mercaptoetanol, pH 8,0. Soluția de actină, care conține 0,3 mM glucoză și 5 U/ml de hexokinază, a fost transferată pe o membrană de dializă Slide-A-Lyser și pusă pe un dispozitiv flotant la +4 °C. A doua zi, înainte de formarea complexului, actina a fost centrifugată timp de 20 de minute la 355.040 × g cu rotorul TLA-120. Proteinele au fost amestecate în raport 1:1,1:1,1 (actina, domeniul HFD, domeniul ADF-H), concentrate la 10-20 mg/ml și utilizate pentru cristalizare ca mai sus. S-au obținut rezultate din mai multe condiții diferite, iar cel mai bun cristal difractant a fost obținut la o concentrație de ~10 mg/ml de complex amestecat 1:1 în 0,1 M HEPES, 0,1 mM KCl, 10% PEG4000 (p/v), pH 7,0 cu o dimensiune a picăturii de 200 nl. În prima zi, în picătură au apărut câteva cristale mici în formă de diamant. În a treia zi, a apărut un cristal mare în formă de tijă, în timp ce toate cristalele mici au fost dizolvate. Pentru colectarea de date de la distanță la Diamond Light Source (Marea Britanie, Didgot) la beamline I03, cristalele au fost crioprotejate prin înmuiere în LV CryoOil (MiTeGen) și congelate rapid în N2 pentru expediere. Datele au fost colectate la 100 K utilizând lungimea de undă de 0,9762 Å, detectorul Pilatus3 6M, o putere de transmisie de 20%, o expunere de 0,05 s și un unghi de oscilație de 0,15° ca un total de 2400 de cadre. Datele de difracție au fost integrate și scalate cu XDS54. O soluție inițială a fost obținută cu înlocuirea moleculară utilizând PHASER55 și PDB = 3daw ca model de căutare care a arătat o densitate suplimentară clară în capătul ascuțit al monomerului de actină. Astfel, a fost efectuată o altă înlocuire moleculară și a fost obținut un model inițial pentru complexul tripartit folosind BALBES58 cu 3daw și 1s0p ca modele de căutare. Astfel s-a obținut o soluție cu Q = 0,787 și Rwork/Rfree = 29,7%/35,6%. Unitatea asimetrică conținea un singur complex 1:1:1:1 de HFD:ADF-H:ADP-actină. Pentru a îmbunătăți modelul au fost necesare mai multe runde de rafinare cu BUSTER56 și construirea manuală în COOT57 , în special reconstruirea buclei D și a buclelor de legătură ale α-helixelor din domeniul HFD. În cele din urmă, adăugarea de ape, introducerea parametrilor de translație-liberație-vârtej (1/lanț) și modelarea factorilor B atomici individuali au dus la obținerea unui model cu Rwork/Rfree final de 16,6%/19,4% cu o geometrie generală bună.

Examinarea interacțiunilor proteină-proteină prin filtrare pe gel

Pentru a studia legarea monomerului de actină, ADP-G-actina a fost preparată așa cum este descris în ref. 34. Toate experimentele de filtrare pe gel au fost efectuate la +4 °C cu o viteză de deplasare de 0,5 ml/min și fracționare de 0,5 ml cu coloana de filtrare pe gel Superdex 200 increase 10/300 GL echilibrată în 5 mM HEPES, 100 mM NaCl, 0,1 mM ADP, 0,1 mM MgCl2, 1 mM DTT, pH 7,4. O sută de microlitri de complex care conține 18 µM de domeniu ADF-H al twinfilinei, 15 µM de alte proteine a fost injectat pe coloană și analizat pentru eluție. Fracțiile de vârf au fost, de asemenea, analizate prin SDS-PAGE. Experimentele de competiție a monomerilor de actină au fost efectuate ca mai sus, prin includerea a 15 µM de domeniu C-CAP sau CARP în probe. Fracțiile de vârf au fost analizate pe SDS-PAGE, gelurile au fost imaginate cu sistemul de imagistică ChemiDoc XRS + (Bio-Rad) și cuantificate cu ajutorul Image Lab (Bio-Rad).

Native-PAGE

Gelurile Mini-Protean TGX 10% (Bio-Rad) au fost rulate în prealabil în tampon de funcționare răcit (25 mM Tris, 195 mM glicină, 0,5 mM ADP, 0,1 mM MgCl2, pH 8,5) timp de 1 h înainte de încărcare. Probele au fost pregătite în tampon de dializă ADP-actină (5 mM HEPES sau Tris, 0,1 mM MgCl2, 0,1 mM EGTA, 0,2 mM ADP, 0,3 mM glucoză, 0,1 mM DTT, pH 8.0) la o concentrație de 20 µM din fiecare proteină, amestecate în proporție de 1:1 cu un tampon de încărcare 2× (tampon de alergare care conține 20% glicerol, albastru de bromofenol, fără ADP sau MgCl2) și apoi se aplică un volum de 5 µl în godeuri de probă de 50 µl. Geloanele au fost rulate la 100 V la gheață timp de 4 h.

Sondaj fluorometric de dezasamblare a filamentelor de actină

Dezasamblarea în regim staționar a filamentelor de ADP-actină a fost realizată după cum urmează: 5% pirena-actină a fost polimerizată în 20 mM HEPES, 100 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 1 mM ATP, 1 mM DTT, pH 7,4 timp de 60 min. Capetele barbate ale filamentelor au fost acoperite cu 50 nM de proteină de acoperire. Ulterior, s-au adăugat 0,5 µM de cofilină (și 0,5 µM de N-CAP), iar reacția a fost inițiată prin adăugarea a 4 µM de proteină de legare a vitaminei D (agent de sechestrare a monomerilor). Concentrația finală de actină a fost de 2,5 µM. Dezasamblarea actinei a fost măsurată prin urmărirea fluorescenței pirenului cu excitație la 365 nm și emisie la 407 nm pe spectrofotometrul de fluorescență (Agilent) timp de 2400 s la 22 °C.

Spectrometrie CD

Spectrele CD pentru N-CAP de tip sălbatic, mutanți și domeniul HFD au fost măsurate la 20 °C cu spectropolarimetrul J-720 (Jasco), în cuvă de cuarț de 300 µl cu o lungime a traseului de lumină de 0,1 cm, cu următorii parametri: mod de scanare continuă cu o viteză de scanare de 50 nm/min, lățime de bandă de 0,5 nm, interval de undă de 190-260 nm, pas de date de 0,5 nm. Toate proteinele au fost diluate la 15 µM cu un tampon PBS 10%. Acumularea a zece scanări pentru fiecare proteină a fost reprezentată sub forma unei singure curbe.

Modeluri pentru simulări MD atomistice

Modelurile de actină decorată cu cofilină s-au bazat pe structura de microscopie crioelectronică cu rezoluție de 3,8 Å (PDBID: 5YU8)41. Buclele lipsă au fost construite cu ajutorul RosettaCM59 și RosettaScripts60 în prezența hărții densității electronice41 care impune simetria elicoidală asociată. Pentru a corespunde construcțiilor experimentale din această lucrare, secvențele de actină și cofilină au fost, în această etapă, schimbate de la cele de pui la cele de iepure și, respectiv, de șoarece. Au fost generate peste 1000 de modele. Acestea au fost, apoi, sortate în funcție de scorul lor total, iar cele care conțineau artefacte structurale (de exemplu, legături peptidice cis) au fost filtrate. Simulările de dinamică moleculară (MD) au fost inițiate pornind de la cele trei modele cu cel mai mare punctaj (tabelul suplimentar 1, simulările F1-3).

Complexul HFD-actină a fost izolat din complexul cristalizat domeniu HFD/actină/twinfilin domeniu ADF-H și andocat separat pe modelele selectate de filament de actină decorat cu cofilină descrise mai sus. În acest scop, HFD-actina izolată a fost suprapusă pe fiecare monomer de actină cu capăt ascuțit, care a fost apoi înlocuit cu HFD-actina. În acest fel, conformația structurii cristaline a dimerului actină-HFD este transferată la vârful actinei decorate cu cofilină. Modelele andocate au fost mai întâi rafinate local cu ajutorul protocolului de andocare61 , urmat de relaxare restrânsă cu ajutorul protocolului fast relax62 distribuit cu Rosetta Software Suite. Acest proces a fost aplicat separat pentru fiecare filament de actină decorat cu cofilină selectat pentru simulările MD (tabelul suplimentar 1, simulările C1-3).

Construcția segmentului de capăt ascuțit pentru simulările MD

Care simulare a fost efectuată pe un segment de capăt ascuțit al modelului de filament de actină decorat cu cofilină selectat, care a fost creat prin felierea modelului perpendicular pe axa filamentului. Planul de feliere a fost ales astfel încât patru monomeri întregi de actină legați de ADP-Mg2+ și trei monomeri întregi de cofilină să fie incluși în segment (tabelul suplimentar 1, simulările F1-3). Segmentul a conținut, de asemenea, cele două domenii HFD de la capătul ascuțit în sistemele legate de HFD (tabelul suplimentar 1, simulările C1-3). Segmentul de la capătul ascuțit conținea, de asemenea, mai multe fragmente polipeptidice de cofiline și actine la capătul său bărbos (figura suplimentară 5a). Pentru a le menține conformația și poziția în timpul simulărilor, aceste lanțuri rupte au fost menținute restricționate din punct de vedere pozițional pe parcursul simulărilor, după cum urmează: Un strat de reziduuri de la interfața cu restul segmentului de capăt ascuțit a fost lăsat liber; toți atomii grei din apropierea planului de tăiere și numai atomii grei din coloana vertebrală pentru regiunile intermediare au fost restricționați cu o constantă de forță de 100 kJ/mol/nm2 (Fig. Suplimentară 5a). Aceste fragmente polipeptidice parțial reținute la capătul bărbos acționează ca o platformă în timpul simulărilor. Această abordare menține atât interfața proteină-proteină de tip filament la capătul bărbos, cât și orientarea filamentului în timpul simulărilor.

Statele de protonare ale reziduurilor au fost determinate la pH neutru pe baza calculelor pKa folosind PROPKA363. Fiecare reziduu H73 al actinei a fost metilat (Nτ-metil-l-histidină, HIC), iar capetele N-terminale ale actinei, cofilinei și HFD au fost acetilate. Topologiile pentru fiecare moleculă din sisteme au fost pregătite cu programul LeAP distribuit cu ambertools1864, care au fost apoi convertite în formatul GROMACS cu ajutorul instrumentului ParmEd.

Care felie de capăt ascuțit creată din modelele selectate a fost plasată într-o cutie de simulare a prismei hexagonale, cu axa sa lungă aliniată cu axa z. Dimensiunile cutiei au fost alese pentru a avea o distanță minimă de aproximativ 17 Å între filament și fiecare față a cutiei (tabelul suplimentar 1). Fiecare sistem a fost solubilizat cu soluție de NaCl 0,15 M, cu numerele de ioni ajustate pentru a neutraliza sistemul.

Înainte de rulările de producție, au fost efectuate minimizarea prin coborârea cea mai abruptă și simulări succesive scurte de echilibrare (în total ~7 ns) în ansamblurile NVT și NpT folosind termostatul Berendsen și barostatul65. În timpul acestor simulări de echilibrare au fost aplicate restricții de poziție armonice la felia de capăt ascuțit. Un grup mai mic de atomi (toți atomii grei, coloana vertebrală a proteinei și, în cele din urmă, doar atomii Cα) au fost restricționați în fiecare simulare de echilibrare consecutivă cu o constantă de forță de 1000 kJ/mol/nm2.

Sistemele care au fost ramificate din celelalte (Tabelul suplimentar 1; C1′, C2′. F2′) au fost pregătite prin efectuarea modificării corespunzătoare (andocarea sau eliminarea domeniilor HFD), eliminarea moleculelor de solvent suprapuse (atunci când domeniile HFD au fost andocate) și reajustarea dimensiunii cutiei și a atomilor de solvent pentru noua dimensiune a sistemului. Echilibrarea NVT și NpT etapizată cu restricții a fost realizată așa cum s-a menționat mai sus (în total ~200 ps pentru simulările în care domeniile HFD au fost îndepărtate și în total ~4 ns în cazul în care este andocat).

Toate execuțiile de producție au fost realizate pentru 1-2.5 μs în ansamblul NpT cu doar restricțiile poziționale menționate mai sus pe regiunea platformei.

Câmpuri de forță și parametri în simulările MD

În simulările MD au fost utilizate următoarele câmpuri de forță și seturi de parametri: Amber ff14sb66 pentru proteine, modelul TIP3P67 pentru apă, setul de parametri pentru ioni monovalenți de Joung și Cheatham68 pentru Na+ și Cl-, un model de ioni octaedrici multisite de Saxena și Sept69 pentru Mg2+ și un set de parametri pentru compuși polifosforilați de Meagher et al.70 pentru ADP. Parametrii legați lipsă pentru metil-histidină (Nτ-metil-l-histidină, HIC) au fost adoptați din câmpul de forță GAFF264. Sarcinile atomice au fost calculate în conformitate cu protocolul lui Duan et al.71 Software-ul R.E.D.III.572 a fost utilizat pentru ajustarea potențialului electrostatic restricționat (RESP) multiconformațional folosind o conformație extinsă și o conformație α-helicoidală a dipeptidei HIC (Ace-HIC-Nme). Toate calculele de chimie cuantică au fost efectuate cu ajutorul suitei de programe Gaussian0973 la nivelul de teorie b3LYP/cc-pVTZ. Calculele de sarcină au fost efectuate cu modelul IEFPCM într-un continuum polarizabil cu o constantă dielectrică de 4 prin setarea solventului ca eter.

Protocoale de simulare MD

Toate simulările au fost efectuate folosind GROMACS 2018 74. Ecuațiile de mișcare au fost integrate utilizând un algoritm leap-frog cu un pas de timp de 2 fs. Toate legăturile au fost constrânse cu ajutorul algoritmului LINCS75. Protocoalele de simulare au fost alese în conformitate cu ref. 66. Interacțiunile electrostatice cu rază lungă de acțiune au fost tratate prin schema Ewald cu ochiuri de particule netede76 , cu o tăiere în spațiul real de 0,8 nm, o spațiere Fourier de 0,12 nm și o interpolare de ordinul patru. Pentru interacțiunile van der Waals a fost utilizat potențialul Lennard-Jones cu un prag de 0,8 nm. S-au aplicat corecții de dispersie cu rază lungă de acțiune pentru energie și presiune77.

Toate simulările de producție au fost efectuate în ansamblul NpT. Felia de capăt ascuțit, platforma și solventul (apă și NaCl 0,15 M) au fost cuplate la băi de temperatură separate la 310 °K folosind termostatul Nosé-Hoover78,79 cu o constantă de timp de 1,0 ps. Cuplarea presiunii izotrope a fost realizată cu ajutorul barostatului Parrinello-Rahman80 cu o presiune de referință de 1 atm, o constantă de timp de 5 ps și o compresibilitate de 4,5 × 10-5 bar-1.

Analiza simulărilor MD

Toate analizele au fost realizate folosind VMD81 și scripturi interne. Calculele MMGBSA au fost efectuate folosind software-ul MMPBSA.py82 distribuit cu ambertools1864 utilizând modelul GB modificat dezvoltat de Onufriev et al.83. cu o concentrație de sare de 0,15 M (cadre eșantionate la fiecare 100 ns, eliminând primii 500 ns din fiecare simulare).

Analize structurale

Pentru analiza diferitelor structuri de actină și a stărilor conformaționale ale acestora prezentate în Fig. 1d, am urmat protocolul lui Tanaka et al41,84. folosind structura F-actinei (PDB 6djo) ca referință.

Analiză statistică și reproductibilitate

Datele din Fig. 2d, 4b și 4d au fost grupate din mai multe experimente efectuate în zile diferite, reprezentând astfel date din mai multe experimente independente. Panourile 2f, 2g, 2h și 3d prezintă date analizate dintr-un singur experiment reprezentativ. n descrie numărul de filamente analizate pentru panourile 2d, 2f, 2g, 4b și 4d. n din panoul 6c corespunde numărului de ori în care a fost efectuat experimentul.

Experimentele din figurile suplimentare 2a-d, 3c, 6a-d au fost efectuate cu rezultate similare de cel puțin două ori. Experimentele din 3d, experimentul de competiție a domeniului CARP din 6a și experimentele în condiții de promovare a asamblării din Fig. 7 au fost efectuate o singură dată.

Rezumat de raportare

Informații suplimentare privind proiectarea cercetării sunt disponibile în Rezumatul de raportare Nature Research, legat de acest articol.

.