Conținutul și proprietățile fluidului intracelular

Acest capitol este vag relevant pentru secțiunea E(iv) din Syllabus 2017 CICM Primary Syllabus, care se așteaptă ca candidatul la examen să „descrie compoziția …fluidului intracelular”. Deoarece aceasta este secțiunea privind fiziologia celulară, accentul se va pune aici în principal pe nivelul microorganizării, iar toate discuțiile despre compartimentul lichidului intracelular vor fi lăsate pentru secțiunea Fluidele corporale.

Faptul că examinatorii de la colegiu nu și-au concentrat niciodată privirea asupra acestui subiect conferă un aer aproape eliberator de inutilitate discuției despre el, deoarece atât candidații la examen, cât și autorul sunt plăcut conștienți de faptul că fiecare își pierde timpul celuilalt. În loc să se îmbuibe cu știința dură și să memoreze fapte care pot fi examinate aici, se poate citi cu ușurință mai departe din motive pur meditative, sau se poate trece mai departe la subiecte care atrag mai multe note.

În rezumat:

Care sunt resursele peer-reviewed valabile pentru acest subiect? Din păcate, acestea sunt numeroase. Atunci când cineva folosește un motor de căutare sau secțiunea de indexare a unui manual pentru a căuta „fluid intracelular”, există inevitabil un răspuns, o serie de intrări sau pagini sau slide-uri powerpoint care – deși toate sunt vag asemănătoare în ceea ce privește conținutul lor – diferă în ceea ce privește valorile citate și nu oferă nimic în materie de referințe. Multe dintre ele nu oferă niciun fel de informații utile. De exemplu, dacă ne întoarcem la cărțile oficiale de colegiu pe această temă (Ganong, p.2 din ediția a 23-a, și Guyton & Hall, p. 4 din ediția a 13-a), găsim concentrațiile de electroliți citosolici discutate folosind termeni precum „cantități mari”. Chiar și în afara bibliografiei oficiale, oferte de altfel solide, cum ar fi Molecular Biology of the Cell, nu au răspunsuri clare. Nici măcar nu reușesc să se pună de acord asupra denumirii (citosol? Protoplasmă? Primordialschlauch?)

Din fericire, există încă oameni de știință care publică pe această temă. Probabil cel mai bun articol este cel din 1999 al lui Katherine Luby-Phelps, care conține, practic, tot ceea ce ați putea avea nevoie pentru a răspunde la orice SAQ-uri viitoare ipotetice pe această temă. Un alt articol excelent care se ocupă în principal de proprietățile materialului intracelular este scurta lucrare a lui Richard P. Sear (2005). Dacă cineva este cu adevărat nebun și dispune de resursele de timp ale unui specialist al personalului cu contract permanent (adică nu are nicio obligație urgentă de a efectua efectiv vreo lucrare utilă), ar putea, în schimb, să exploreze cartea lui Gilbert Ling, In Search of the Physical Basis of Life (1984), o carte de 800 de pagini scrisă de un om ale cărui publicații despre fiziologia celulară se întind până în anii 1950.

Volumul unui spațiu intracelular

Cât de mare este o celulă? Evident, acest lucru depinde de celulă. Un bun exemplu aberant este ovocitele lui Xenopus, oul unei broaște africane cu gheare, care are un diametru de 1 mm. Atunci când discutăm despre oameni, ne referim de obicei la lichidul intracelular ca și cum ar fi o găleată relativ omogenă, dar, de fapt, acel compartiment de lichid este compus din ceva de genul 1014 compartimente minuscule, fiecare dintre ele având un volum și o compoziție ușor diferite.

Eterogenitatea tuturor acestor volume este bine rezumată în acest capitol al bazei de date BioNumbers, unde pot fi găsite tot felul de informații meticulos referențiate. El este reprodus aici cu modificări minime, în cazul în care serverele Harvard se vor bloca vreodată.

Volumele celulelor de mamifere

Tipul de celulă	Volumele (μm3, sau femtolitri)	Volum (picolitri)	Referință
Celulă spermatozoidă	30	0.03		Gilmore et al, 1995
Eritrocite	100	0.1	Ballas et al, 1987
Limfocite	130	0,13	Schmid-Schonbein et al, 1980
Neutrofile	300	0.3	Rosengren et al, 1994
Celula β pancreatică	1.000	1.0	Finegood et al, 1995
Enterocit	1,400	1.4	Wiśniewski et al, 2012
Fibroblast	2,000	2.0	Mitsui et al, 1976
Tumor cervical (HeLa)	3,000	3.0	Zhao et al, 2008
Celule de păr (ureche)	4,000	4.0	Géléoc et al, 1999
Osteoblast	4,000	4.0	Beck et al, 2011
Macrofag alveolar	5,000	5.0	Krombach et al, 1997
Cardiomiocite	15,000	15.0	Calvillo et al, 2003
Megacariocite	30,000	30.0	Harker et al, 2000
Adipocit	60,000	60.0	Livingston et al, 1984
Oocit	4.000.000	4000	Goyanes et al, 1990

Deci, este o gamă destul de largă. În plus, în mod evident, nu tot conținutul celulei va fi ocupat de „lichidul intracelular”, indiferent de definiția pe care o dați acestui termen. De exemplu, în scopul acestui capitol, definiția fluidului intracelular va fi „conținutul intracelular care nu este reprezentat de organite”, pur și simplu pentru că organitele sunt discutate în alt capitol. Ceea ce vorbim, în acest caz, este „substanța cenușie, vâscoasă, vâscoasă, semitransparentă și semifluidă” care ocupă spațiul intracelular dintre alte structuri (Harvey, 1937).

În funcție de tipul de celulă la care vă uitați, acel spațiu ar putea fi o proporție foarte mică din volumul total. De exemplu, în adipocitele omentale enumerate mai sus, din acei 60 de picolitri de volum total, marea majoritate va fi ocupată de grăsime fără apă. Acest lucru poate fi demonstrat experimental: DiGirolamo & Owens (1976) au reușit să calculeze că volumul de apă din adipocitele de șobolan era de aproximativ 5-7% din volumul total, adică 1,5-2 picolitri.

În concluzie, avem de-a face cu un volum foarte mic. De ce contează acest lucru? Ei bine. Volumul lichidului intern al celulei de 1-2 picolitri este volumul de distribuție pentru substanțele solubile. Prin urmare, moleculele acestor substanțe au de parcurs o distanță foarte scurtă înainte de a se întâlni între ele. Efectul este acela de a crește rata reacțiilor, ceea ce este util, deoarece cantitatea totală de molecule de reactiv pentru un volum atât de mic este în mod necesar mică. Pentru a împrumuta un exemplu de la Luby-Phelps (2000), dacă o celulă are un conținut total de 1 nanomol de o proteină, aceasta înseamnă că în celulă sunt prezente doar 1000 de copii ale acelei proteine. Din fericire, cu un volum atât de mic de străbătut, o moleculă de legare, chiar și cu o afinitate scăzută, ar fi capabilă să frece și să adsorbe majoritatea substratului disponibil.

Contenutul proteic al fluidului intracelular

Ok, deci volumul este mic. Ce macromolecule se află în el și cât de multe dintre ele? Alice B. Fulton (1982) a cântărit în acest sens cu probabil cel mai lucid răspuns din literatura publicată. Practic, conținutul de proteine al celulelor este cuprins între 17 și 35% din greutate, majoritatea autorilor încadrându-se undeva la 20-30g/100ml. Fulton citează texte antice (Loewy et al, 1969) pentru a da următoarele valori:

• Celule musculare: 23% proteine în greutate
• Eritrocite: 35% proteine în greutate
• Majoritatea celorlalte celule: 17% până la 26% proteine în greutate

Măsurătorile se fac de obicei prin măsurători ale indicelui de refracție, care este o tehnică ce nu discriminează, de obicei, între proteinele structurale (de exemplu, cele din care sunt compuse citoscheletul și organitele) și proteinele solubile care alcătuiesc restul glucozei.

Deci, care este rostul acestei discuții? Păi. Această concentrație de proteine este destul de mare. Este peste concentrația de polimeri mari, acceptată de obicei, care ar trebui să afecteze difuzia altor polimeri asemănători, adică pădurea este prea densă. Chang et al. (1987) au elaborat un model matematic care prevede că, pentru polimerii de 50kDa și mai mult, limita de difuzie este de aproximativ 130g/L, adică, dacă se depășește această valoare, alți polimeri nu vor putea difuza cu ușurință prin soluție. Sigur, ei au folosit polistiren dizolvat în benzen, dar faptul rămâne. Pentru comparație, atunci când se cristalizează complet o proteină, se ajunge la un „solid” care are doar 40% proteine în greutate

În concluzie, proteinele din fluidul intracelular sunt atât de strâns împachetate, încât citosolul trebuie să fie descris ca o „soluție aglomerată”. Diagrama caricaturală de aici (publicată inițial de Goodsell în 1993 și reprodusă ulterior de aproape toți cei care au scris vreodată despre citosol) demonstrează vizual exact cât de strâns împachetate sunt aceste corpuri. Desenul a fost realizat cu aproximație, folosind dimensiuni și forme cunoscute ale moleculelor/ microscopului cu electroni, dar imaginile realizate prin SEM (de exemplu, de Bridgman & Reese, 1984) demonstrează că reprezintă corect microstructura dezordonată a citosolului. Privind ovocitele Xenopus la o mărire de ~ 80.000, devine evidentă o pădure densă de filamente și granule. Imaginea de aici (o parte din Figura 6 a acestora) a fost de fapt curățată puțin prin liză celulară și spălare cu detergent, pentru a elimina o parte din încărcătura de proteine care, altfel, ar fi ascuns structura mai fină. Săgețile indică joncțiunile filamentelor Y și T.

Fără prepararea cu detergent, tot materialul granular fin împachetat între aceste filamente devine vizibil. Imaginea seamănă acum cu zgomotul alb (aceiași autori).

Evident, difuzia prin acest tufiș nu va fi normală. Soluții mai mici (de exemplu, ionii dvs. de sodiu și potasiu) trebuie să navigheze în jurul acestor obstacole uriașe, luând ruta pitorească spre fiecare dintre ei. Din punct de vedere practic, acest lucru ar trebui să însemne că orice reacție care depinde de viteza de difuzie va fi mai lentă. Dacă moleculele au nevoie de o veșnicie pentru a ajunge una la cealaltă, cu siguranță rata netă a interacțiunii lor ar trebui să fie redusă. Cu toate acestea, noi nu vedem acest lucru.

Ce proprietăți chimice observăm, cu această supă proteică foarte saturată? Allen P. Minton (2006) a sintetizat ani de cercetări (în principal ale sale) într-un tabel al lucrării menționate mai sus. Acesta este rezumat aici:

• Afinitatea de legare crescută a macromoleculelor altfel diluate unele pentru altele
• Accelerarea asociațiilor proteice, de ex. autoasamblare
• Decelerarea reacțiilor limitate de difuzie și a asociațiilor proteice
• Stabilizarea proteinelor împotriva denaturării termice

În rezumat, aglomerarea forțează proteinele să se plieze și să interacționeze, ceea ce produce configurații complexe care altfel ar fi imposibile într-o soluție diluată. De exemplu, Wilf & Minton, în 1981, a descoperit că moleculele de mioglobină diluate în soluție au puțin interes unele față de altele, dar adăugarea unei soluții de 10% de (orice!) altă proteină determină mioglobina să se adune spontan în dimeri.

Proprietăți ale apei intracelulare

Chiar și într-o proteină cristalizată, doar 40% din masă este proteină propriu-zisă. Restul este solvent care ocupă spațiile dintre moleculele de proteină ambalate (acestea nu sunt exact dreptunghiuri și nu se suprapun în mod ordonat). Atunci când solventul este apă, jumătate din el sfârșește prin a fi adsorbit pe suprafața proteinei, dar restul poate fi privit în continuare ca apă lichidă normală. În această peliculă subțire, ionii din apa intracelulară sunt dizolvați.

Evident, în cazul apei adsorbite legate, lucrurile sunt ușor diferite. De exemplu, proprietățile de solvent ale acestei ape nu vor fi exact aceleași cu cele ale apei „libere”. În primul rând, va avea probabil o activitate chimică redusă. După cum ne-am putea aștepta, starea „ordonată” a apei îi conferă câteva proprietăți coligative neobișnuite – de exemplu, Foster et al. (1976) au descoperit că punctul său de îngheț este scăzut. Mai mult decât atât, vor exista buzunare de citosol cu activitate crescută (în jurul structurilor proteice hidrofile) și activitate scăzută (în jurul celor hidrofobe).

Cât de multă apă este menținută în această stare captivă de către proteine? Este oarecum dificil de spus. Experimentele realizate de Ling et al. (1993) sugerează că în interiorul celulelor, cea mai mare parte a apei este „ordonată” în acest mod, dar majoritatea experimentelor care raportează acest subiect sunt oarecum afectate de faptul că celulele vii brute pe care le folosesc au diverse răspunsuri homeostatice la condițiile experimentale care confundă rezultatele.

În general, oamenii încearcă să stabilească acest răspuns prin deshidratarea osmotică a celulelor. Aplică o presiune osmotică, raționează ei, și toată apa „mobilă” ar trebui să iasă din celulă. Apoi se măsoară conținutul de apă al celulei, iar tot ceea ce rămâne trebuie să fie „imobil”, parcat pe suprafața moleculelor de proteine și incapabil să migreze ca răspuns la presiunea osmotică. Cameron et al. (1997) prezintă graficul (furat fără rușine și afișat aici, în stânga) în care conținutul de apă al celulelor rămase este reprezentat pe o axă x de creștere a presiunii osmotice. Linia presiune vs. apă rămasă, atunci când a fost extrapolată din dovezile experimentale și extinsă spre o presiune osmotică „infinită”, a sfârșit prin a intersecta axa y într-un punct diferit de zero. În funcție de celulele pe care le foloseai, aceasta a ajuns să fie undeva între 30-90% din conținutul total de apă.

De fapt, se pare că această apă adsorbită pe proteine este apa esențială din celule, iar toată apa „liberă” este un balast inutil. Clegg (1981), rehidratând niște celule uscate de creveți de saramură, a constatat că activitatea metabolică a fost reluată și a fost relativ normală atunci când celulele au fost reintroduse cu aproximativ 35% apă în greutate. adică cam atât cât este de așteptat pentru a „hidrata” toate macromoleculele. În acei creveți, aproape sigur nu era prezentă apă liberă în „faza de masă”. Sigur, ei nu încercau să se reproducă sau să sintetizeze ARN (care necesitau o hidratare de până la 70-80%), dar sinteza aminoacizilor și schimbul de gaze au continuat relativ normal. Acest lucru face cu atât mai remarcabil faptul că, atunci când este măsurat în mod obiectiv, această supă groasă de 20-30% de proteine are o vâscozitate care seamănă foarte mult cu cea a apei normale (Luby-Phelps, 1994)

Ph-ul fluidului intracelular

Carter (1972) a publicat un articol extrem de influent în acest sens, care este adesea citat în manualele de fiziologie umană, chiar dacă autorul a folosit mușchi de la cîrtița uriașă (Balanus nubilus) pe care i-a suspendat în ceva numit „soluție Ringer de cîrtiță”, o saramură care conține 450 mmol/L de sodiu și 518 mmol/L de clorură. Cu greu se poate citi mai departe cu vreun nivel de respect pentru generalizabilitatea umană a unor astfel de date, dar dacă o facem, vom descoperi cea mai importantă constatare: că pH-ul din celule este atât de mult compartimentat încât diferite regiuni ale citosolului aveau valori de pH extrem de diferite, într-un interval de 6,0-7,5.

Concentrațiile de electroliți intracelulari

În general, toate manualele, atunci când sunt întrebate despre concentrația de electroliți din lichidul intracelular, vor produce o Gamblegramă ca aceasta (preluată în mod abuziv din Ling, 1984, fără permisiunea succesiunii sau a editorului său).

Această diagramă de aici nu este menționată în cartea lui Ling, dar s-ar putea argumenta că nu trebuie să fie, având în vedere că Ling a făcut practic toată munca de pionierat privind determinarea comportamentului soluților intracelulari. Mai exact, în anii 1960, el și Ochsenfeld au determinat că acest potasiu (și toți ceilalți electroliți din citosol) nu este, în general, prezent într-o formă liber disponibilă, ci este în schimb adsorbit pe structurile macromoleculare.

Cercetatorii au provocat celulele cu izotopi radiomarcați și au constatat că acest lucru a avut un efect redus asupra deplasării electroliților deja prezenți acolo, ceea ce ar fi fost de așteptat dacă aceștia ar fi fost distribuiți liber. Electroliții intracelulari sunt în mare parte prezenți în complexe cu macromolecule și sunt mult mai puțin mobili decât ne-am putea aștepta dintr-un model de celulă în care tot conținutul există într-un sac apos omogen. Aceiași autori (Ling & Ochsenfeld, 1973) au confirmat ulterior că mobilitatea potasiului din compartimentul intracelular în cel extracelular a fost de aproximativ o optime din ceea ce s-ar putea aștepta din difuzia simplă în soluție liberă. Mușchiul de broască ucis a scurs potasiu ceva mai ușor (rata de difuzie a fost redusă doar cu 25% față de cea așteptată), deoarece pompele alimentate cu ATP au încetat să mai funcționeze și structura proteinelor s-a dezorganizat.

Deci, să fim de acord că acești ioni nu sunt dizolvați într-un lac de apă intracelulară liberă, ci mai degrabă legați în complexe. Asta tot nu răspunde la întrebarea: cât de mult din ce se află acolo? Se pare că este relativ ușor de răspuns. Mult mai ușor, de fapt, decât oricare dintre celelalte întrebări ridicate până acum în acest capitol. Trebuie doar să luăm citosolul cuiva, să-l liofilizăm și apoi să măsurăm compoziția elementară a masei uscate. Mason et al. (1981) au făcut exact acest lucru pentru unele celule tubulare renale, înainte și după o leziune ischemică. Rezultatele lor sunt reproduse mai jos, atât sub forma tabelului original din 1981, cât și a unei frumoase și strălucitoare Gamblegrame:

După cum se poate observa din fluctuațiile sălbatice ale concentrației de potasiu după chiar și 20 de minute de ischemie, compoziția electrolitică a celulelor este mult mai fluidă decât cea a lichidului extracelular (unde o schimbare de 20 mmol în concentrația oricărui electrolitic ar fi slab tolerată, la un nivel de supraviețuire existențială a organismului). În plus, fiecare linie celulară va avea o concentrație intracelulară de ioni ușor diferită. Acest lucru dă naștere la imprecizia valorilor electroliților intracelulari discutate în manuale și la reticența generală a acestora de a cita orice număr. Practic, orice număr pe care îl veți cita va fi greșit. De exemplu, tubulii distali ai lui Mason aveau 11 mmol/L de sodiu în citosol, dar Poole-Wilson (1975) a găsit aproximativ 44 mmol/L în miocitele ventriculului stâng și 20 mmol/L în cvadricepsul stâng. Alam et al. (1977) au dat valori de aproximativ 25 mmol/L pentru sodiu și 145 mmol/L pentru potasiu în unele celule hepatice aflate în insuficiență. Pe scurt, mediul dezordonat și imprevizibil al oricărei celule date face dificilă citarea unor cifre specifice.

.