O número de cópias da Metiltransferase O6-Metilguanina-DNA Metiltransferase (MGMT) é determinado em relação ao número de cópias da beta-actina (ACTB) pela reação em cadeia da polimerase específica da metilação em tempo real (MSP). Para isso, o conteúdo do tecido tumoral é enriquecido pela microdissecção manual seguida pela extração de DNA. O DNA é quantificado usando Picogreen e modificado pelo tratamento com bissulfito que faz com que as citosinas não metiladas sejam convertidas em uracyl enquanto as citosinas metiladas permanecem inalteradas. Subsequentemente, é realizada uma PCR específica de Metilação em tempo real (MSP) no instrumento Quantstudio 5 para quantificar o número de cópias de MGMT e ACTB (1). Esta técnica consiste em realizar uma PCR com detecção em tempo real usando o sistema de detecção de amplifluor. Amostras com um número de cópia desconhecido podem ser quantificadas por comparação dos seus valores Ct com os de uma curva padrão plasmídeo.
Clinical Implication
MGMT é uma enzima de reparação de ADN que é frequentemente desactivada por hipermetrotilação no cancro humano. Quando as células não têm actividade MGMT, os danos no ADN não são reparados adequadamente, tornando um indivíduo mais propenso ao desenvolvimento do cancro. De interesse, esta falta de actividade do MGMT também torna uma célula tumoral mais sensível à radioterapia e a certos medicamentos alquilantes como a temozolomida (2). No estudo de validação internacional de prognóstico de Fase III (RTOG 0525), o ensaio de MGMT identificou com sucesso pacientes com glioblastoma recém-diagnosticado que têm maior probabilidade de viver mais tempo e de ter um período de tempo livre de progressão mais longo após o tratamento com temozolomida (3-5). Recentemente, foi publicada uma nova publicação na qual pacientes metilados e com “zona cinzenta” tiveram um desempenho significativamente melhor para a sobrevida global do que pacientes realmente não metilados (6).
Requisitos de espécimes
As amostras aceitáveis para o ensaio são amostras de tecido de glioma fixadas em formol e incluídas em parafina, com um tempo de fixação de 6-48 horas.
Volume
É preferível um bloco de parafina representativo. Alternativamente, 5 secções de tecido não manchado são aceites (1 lâmina de 5 µm de espessura para coloração de H&E e um mínimo de 4 lâminas de 5-10 µm de espessura para teste MGMT).
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Instruções de armazenamento e expedição
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Manter e expedir espécimes à temperatura ambiente.
Limitações
Para algumas amostras, um resultado inválido será obtido devido a um número insuficiente de cópias ACTB em combinação com um número de cópias MGMT abaixo do limite de detecção. A maioria das vezes, isto é explicado pela quantidade e/ou qualidade insuficiente de ADN. Para amostras inválidas com um número de cópias para MGMT e/ou ACTB em torno do LOD/LOQ e do corte, recomenda-se a realização de um novo teste a partir do ADN tratado com bissulfito. Outros fixadores que não formalina ou tempo de fixação prolongado podem dar origem a resultados inadequados.
Requisitos Especiais
Nenhum
Tempo de Volta-Tudo
Cinco a sete dias úteis para lâminas e blocos de parafina respectivamente.
- Vlassenbroeck I et al. Validação da PCR específica da Metiltilação em Tempo Real para determinar a Metiltransferase O6-Metilguanina-DNA Metiltransferase Gene Promotor da Metilação em Glioma. J Mol Diagn. 2008 Jul;10(4):332-7
- Hegi ME et al. Silenciamento do gene MGMT e benefício da temozolomida no glioblastoma. N Engl J Med 2005 Mar 10;352(10):997-1003.
- Gilbert MR et al. Dose-dense temozolomide para glioblastoma recém-diagnosticado: um ensaio clínico fase III aleatório.(7). J Clin Oncol. 2013 Nov 10;31(32):4085-91.
- Malmström A et al. Temozolomide versus radioterapia padrão de 6 semanas versus radioterapia hipofracionada em pacientes com mais de 60 anos com glioblastoma: o ensaio nórdico randomizado, fase 3. Lancet Oncol 2012 set; 13(9): 916-926.
- Wick W et al. Temozolomide chemotherapy alone versus radiotherapy alone for malignant astrocytoma in the elderly: the NOA-08 randomised, phase 3 trial. Lancet Oncol 2012 Jul; 13(7): 707-715.
- Hegi ME et al. MGMT Promoter Methylation Cutoff with Safety Margin for Selecting Glioblastoma Patients into Trials Omitting Temozolomide. Uma análise conjunta de quatro ensaios clínicos. Clin Cancer Res 2019 Mar 15; 25(6): 1809-1816.
Atualizado em 23 de Maio de 2019