Técnicas de Anticorpos Fluorescentes

Por Benedette Cuffari, M.Sc.Reviewed by Emily Henderson, B.Sc.

Desde sua descoberta original em 1942, a coloração por imunofluorescência tem permanecido uma técnica altamente confiável e poderosa para uma ampla gama de pesquisas e propósitos diagnósticos.

Células de leucemia rotuladas com moléculas fluorescentes. Crédito da Imagem: Vshivkova/.com

Em geral, as técnicas de anticorpos fluorescentes (FA) envolverão o uso de células ou um anticorpo, cuja região constante foi marcada com um rótulo fluorescente, também conhecido como fluoróforo. As técnicas de FA são frequentemente categorizadas como directas ou indirectas.

Anticorpo fluorescente directo

A técnica de anticorpo fluorescente directo, que de outra forma pode ser referida como imunofluorescência directa (DIF), envolve o uso de um único anticorpo primário rotulado fluorescentemente que é usado para se ligar a um antígeno alvo. Quando usada clinicamente, a DIF é particularmente útil para o diagnóstico rápido de doenças bacterianas como Streptococcus pyogenes, que é mais comumente conhecido como estreptococos, bem como pneumonia que é o resultado das espécies Mycoplasma pneumoniae e Legionella pneumophilia.

Para tais fins de diagnóstico, a amostra do doente é primeiro colocada numa lâmina de microscópio e depois exposta ao anticorpo fluorescente. Qualquer ligação entre o anticorpo com marcação fluorescente e o antígeno alvo, que para estas situações seriam bactérias, fará com que estas substâncias se iluminem ao exame com um microscópio de fluorescência.

Para além da sua utilização como ferramenta de diagnóstico, o DIF é também largamente utilizado para estudos de investigação científica. Para tais fins, uma amostra de tecido congelado que foi cortada em secções finas de 5 ou 6 micrómetros (µm) é colocada numa lâmina de vidro.

As lâminas são então incubadas com um anticorpo com marcação fluorescente, que normalmente incluirá um painel de anticorpos que são dirigidos contra os isótipos de anticorpos IgA, IgG, e IgM juntamente com o complemento 3, que é dirigido contra o antigénio de interesse.

Nota que a concentração do anticorpo usado para este tipo de estudo será baseada em experiências anteriores que confirmaram qual a concentração que pode alcançar a maior relação sinal-fundo.

Após as lâminas terem sido incubadas durante pelo menos 30 minutos no escuro e à temperatura ambiente, as lâminas são lavadas e depois imitadas com um microscópio de fluorescência.

Crédito Imagem: anyaivanova/.com

Anticorpo fluorescente indirecto

As comparado com a técnica de um único passo usada para DIF, IF indirecto (IIF) ou FA indirecto (IFA) é um processo de dois passos que começa com a aplicação de um anticorpo primário não rotulado na amostra que é dirigido contra um antigénio alvo. A segunda etapa da IIF envolve o uso de um anticorpo secundário marcado fluorescente que é dirigido contra a porção Fc do anticorpo primário.

Embora a IIF seja considerada mais complicada do que a DIF, pois leva mais tempo para ser completada e requer o uso de dois anticorpos compatíveis, ela é superior em termos de suas capacidades de sensibilidade.

Algumas aplicações clínicas comuns dos testes IFA incluem aquelas usadas para o diagnóstico da sífilis. Para este tipo de teste de IFA, células de T. paládio que foram previamente isoladas de um animal de pesquisa são isoladas e colocadas na superfície de uma lâmina de vidro. Um soro que foi adquirido de um paciente é então espalhado sobre as células de T. paládio para permitir que anticorpos anti-treponêmicos, caso estejam presentes, se liguem aos antígenos fixos.

Após a amostra sérica do paciente ser lavada, um anticorpo secundário que tenha sido marcado com um fluoróforo é adicionado. Um resultado positivo de sífilis irá iluminar todos os complexos conjugados anticorpo-fluoróforo secundário.

Um outro tipo de IFA que é amplamente usado em ambientes clínicos é o que é usado para o diagnóstico de lúpus eritematoso sistêmico (LES). Os doentes com LES, que é uma doença auto-imune, terão um nível aumentado de auto-anticorpos anti-nucleares (ANA) circulantes que são alvo tanto de ADN como de várias proteínas que se ligam ao ADN.

Para este tipo de teste IFA, as células são cultivadas e depois colocadas numa lâmina de vidro. Cada lâmina é então incubada com uma concentração diferente do anticorpo do paciente, que é então lavado para remover quaisquer proteínas não ligadas.

Após o passo de lavagem, um anticorpo secundário marcado com fluorescente, que para o teste de ANA será anti-humano IgG, é adicionado às lâminas e permitido incubar. Um título do ANA no soro é então obtido a partir da maior diluição sérica que mostrou fluorescência e usado para determinar um diagnóstico de LES.

Citometria de fluxo

O terceiro tipo de técnica de anticorpos fluorescentes inclui a citometria de fluxo, que é um sistema automatizado de contagem de células que pode ser usado para quantificar células específicas que estão presentes em misturas complexas, como sangue ou soro.

Uma experiência típica de citometria de fluxo começará com a incubação de um anticorpo marcado com fluorescência que é dirigido contra uma subpopulação específica de células, como o anti-CD4, que pode ligar-se à glicoproteína CD4 encontrada na superfície de várias células imunes, incluindo células T helper, monócitos e macrófagos. A citometria de fluxo também pode quantificar a presença de múltiplos tipos de células usando fabricantes de células apropriados.

Após a conclusão da incubação, a amostra é então introduzida no citômetro de fluxo. Dentro desta máquina, uma estreita força capilar as células presentes dentro da amostra para se moverem em um único arquivo. medida que as células se movem através do capilar, um laser é utilizado para ativar e excitar quaisquer células que tenham sido marcadas com o fluoróforo.

A intensidade de fluorescência de cada célula excitada é então medida tanto por detectores de dispersão para frente quanto lateral e representada em um histograma para análise. Além da quantificação, tanto a citometria de fluxo quanto a imunofluorescência podem ser usadas para classificar células em subpopulações purificadas para fins de pesquisa através de uma técnica conhecida como classificador de células ativadas por fluorescência (FACS).

• Odell, I. D., & Cook, D. (2013). Técnicas de imunofluorescência. Journal of Investigative Dermatology 133. doi:10.1038/jid.2012.455.
• Parker, N., Schneegurt, M., Tu, A. T., et al. (2016). Capítulo 20.5 Técnicas de Anticorpos Fluorescentes. In: Microbiologia. Acesso a partir de https://openstax.org/books/microbiology/pages/20-5-fluorescent-antibody-techniques.
• Betterle, C., & Zanchetta, R. (2012). As técnicas de imunofluorescência no diagnóstico de doenças auto-imunes endócrinas. Autoimunidade Destaques 3(2); 67-78. doi:10.1007/s13317-012-0034-3.

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Escrito por

Benedette Cuffari

Depois de completar o seu Bacharelato em Toxicologia com dois menores em Espanhol e Química em 2016, Benedette continuou seus estudos para completar seu mestrado em Toxicologia em maio de 2018. Durante a pós-graduação, Benedette investigou a dermatotoxicidade da mecloretamina e da bendamustina; dois agentes alquilantes de mostarda de nitrogênio que são usados na terapia anticancerígena.

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