Materiais e Métodos
Participantes
Subjetos foram 83 crianças com TDAH (75% homens) e 72 crianças com TD (51% homens), com idades entre 6 e 13 anos. Os critérios de inclusão para o grupo com TDAH foram: (a) diagnóstico clínico de TDA/H segundo os critérios do DSM-IV, (b) confirmação deste diagnóstico pelo Diagnostic Interview Schedule for Children, quarta edição, administrado aos pais (DISC-IV-P; ), (c) sintomas significativos de TDAH, conforme indicado pelas classificações dos pais >90º percentil, em pelo menos uma das escalas de TDAH (Inatenção e Hiperactividade/Impulsividade) da Escala de Classificação dos Distúrbios do Comportamento Perturbador (DBDRS; ), e (d) sintomas generalizados de TDAH, conforme indicado pelas classificações dos professores >75º percentil, em pelo menos uma das escalas de TDAH de DBDRS. Ter um diagnóstico comorbido (por exemplo, ODD ou ASD) não foi critério de exclusão, nem o tratamento com medicação estimulante. Crianças com medicação estimulante (N = 50, 60% do grupo TDAH) interromperam o uso de drogas 24 horas antes do teste, a fim de permitir uma lavagem completa, e durante a participação em nosso estudo. Os critérios de inclusão para o grupo TD foram: (a) ausência de diagnóstico clínico de qualquer distúrbio de desenvolvimento ou de comportamento (incluindo TDAH e TDAO), e (b) escores <90º percentil de TDAH nas escalas de TDAH, tanto na escala de pais quanto na de professores, do grupo DBDRS.
Materiais
Comportamento.
Os pais das crianças elegíveis para inclusão no grupo TDAH foram avaliados com a seção de distúrbio de comportamento disruptivo do DISC-IV-P. O DISC-IV-P é uma entrevista diagnóstica padronizada amplamente utilizada para a avaliação de distúrbios psiquiátricos infantis DSM-IV, com propriedades psicométricas adequadas .
Pais e professores de crianças tanto do grupo TDAH como do grupo TD completaram o DBDRS para avaliar os sintomas de TDAH e sintomas de TDAH e DC. O DBDRS contém quatro escalas que medem os sintomas de desatenção, hiperatividade/impulsividade, ODD e DC em uma escala de 4 pontos Likert (variando de 0 a 3), com escores mais altos indicando piores sintomas. Foram relatadas propriedades psicométricas adequadas para o DBDRS .
As Forças e Fraquezas dos sintomas de TDAH e a escala de classificação de Comportamento Normal (SWAN; ) foi completada pelos pais e professores para avaliar os sintomas de TDAH. Este questionário amplamente utilizado contém duas subescalas; a escala de desatenção e a escala de Hiperactividade/Impulsividade, cada uma compreendendo 9 itens. Os itens são pontuados em uma escala de 7 pontos do Likert (variando de -3 a +3), com pontuações mais altas indicando piores sintomas. Os itens são baseados nos sintomas de TDAH do DSM-IV, mas refletem os dois extremos (forte e fraco) do comportamento descrito em cada sintoma de TDAH. Como variáveis dependentes, foram utilizadas pontuações médias em ambas as subescalas. As propriedades psicométricas adequadas foram relatadas para a SWAN .
SASD sintomas foram avaliados usando a Escala de Resposta Social (SRS; ) de 65 itens, completada pelos pais e professores. Os itens da Escala de Responsabilidade Social são baseados nos domínios dos sintomas do DSM-IV da CIA, incluindo a deficiência na interação social, déficits comunicativos e padrões de comportamento ou interesses restritos/estereotipados. O SRS usa uma escala de 4 pontos do Likert (variando de 0 a 3), e a pontuação do item somado na escala total do SRS foi usada como medida dependente, com pontuação mais alta indicando piores sintomas. A SRS tem propriedades psicométricas adequadas .
Blood spots.
Para investigar as concentrações sanguíneas de triptofano, tirosina e fenilalanina, foi utilizada uma técnica de sangue seco spot. A coleta de manchas de sangue é menos invasiva para crianças do que a coleta de amostras de sangue venoso e a técnica da mancha de sangue seco é suficientemente robusta e estável para fins diagnósticos . As concentrações de AAA da mancha de sangue estão altamente correlacionadas com as concentrações séricas de AAA (rs variando de .86 a .96) . Uma mancha de sangue de cada criança foi colhida usando uma lanceta de segurança descartável. Três gotas de sangue foram manchadas em um cartão de mancha de sangue. Uma punção de 5,5 mm de uma mancha de sangue seco foi misturada com 100μl de uma solução padrão interna (contendo 29μM L-fenilalanina-D5, 6μM L-tirosina-D4 e 5μM L-triptofano D5) e 400μl metanol em um frasco de cromatografia gasosa (GC-vial) e agitado por 15 minutos em um banho ultra-sônico. O sobrenadante foi transferido em outro GC-vial e evaporado sob nitrogênio a 30°C. Posteriormente, a amostra foi butilada com 100μl de cloreto de acetil 5,5% (em n-butanol) a 60°C por 15 minutos. Posteriormente, a camada de butanol foi evaporada sob nitrogênio (a 30°C) e o resíduo foi dissolvido em 500μl acetonitrila. As concentrações de triptófano, tirosina e fenilalanina no sangue foram determinadas por cromatografia líquida tandem positiva (LC-MS/MS), usando um espectrômetro de massa API 3000 quadrupole triplo (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA), acoplado a um sistema de cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) (Perkin Elmer Series 200, Shelton, EUA). Três μl da amostra foram injetados em uma coluna C18 de simetria (3,9*150mm, 5μm; Waters, Milford, MA, EUA) e eluídos com um fluxo de 1ml/min de 75% de acetonitrilo (contendo 0,4% de ácido fórmico). Triptófano, tirosina e fenilalanina eluídos em 1 minuto e foram medidos usando as transições: relação massa/carga (m/z) 261.2→159.2 (triptofano), m/z 238.2→136.2 (tirosina) e m/z 222.2→120.2 (fenilalanina). Todos os dados LC-MS/MS obtidos foram adquiridos e processados usando o software Analyst 1.4.2 (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). As concentrações de triptófano, tirosina e fenilalanina no sangue foram expressas em μmole/L. A confiabilidade do LC-MS/MS foi confirmada através do exame da variância inter-ensaio (sendo 5-10%), variância intra-ensaio (sendo 8-10%) e recuperação (sendo 90-112%).
Infusão de proteína dietética.
Infusão de proteína diária foi avaliada durante três dias, utilizando um diário nutricional relatado pelos pais. Registros dietéticos padronizados e instruções foram fornecidos. Os pais foram instruídos a registrar todos os alimentos e bebidas consumidos no registro dietético e a expressar as quantidades consumidas da forma mais precisa possível. A quantidade de proteína ingerida (gramas/dia) foi calculada com base em uma versão computadorizada da base de dados holandesa sobre a composição dos alimentos. A base de dados holandesa da composição dos alimentos contém mais de 2000 produtos alimentares com informação sobre a composição nutricional destes produtos alimentares . A base de dados é amplamente utilizada para fins científicos (por exemplo).
Urina.
Para examinar as concentrações de AAA urinário, os participantes coletaram toda a urina excretada em 18 horas consecutivas (após o horário escolar) em um recipiente de coleta de urina. Durante a coleta de urina, o recipiente foi armazenado em um refrigerador (<5°C). Uma amostra de 10ml foi enviada para um laboratório para análise, onde a amostra foi armazenada a -20°C. Uma técnica de HPLC com detecção de fluorescência foi utilizada para a análise do triptofano na urina. As concentrações de tirosina e fenilalanina na urina foram determinadas utilizando um analisador de aminoácidos Biochrom . As concentrações urinárias de triptofano, tirosina e fenilalanina foram expressas por uma razão de μmole para o volume total de urina, para descartar efeitos da poliúria ou oligúria. A confiabilidade da técnica de HPLC foi confirmada pelo exame da precisão das análises, sendo 2,25% para o triptofano (desvio padrão relativo), e 1,50% para a tirosina e fenilalanina. Há altas correlações entre as concentrações de aminoácidos em amostras de 12 horas e amostras de 24 horas, indicando que não há variação diurna na excreção dos aminoácidos, validando o uso de uma amostra de 18 horas no estudo atual.
Procedimento
Este estudo recebeu aprovação do comitê de ética médica local do VU University Medical Center Amsterdam, Holanda (#NL39922.029.12), e foi realizado de acordo com os padrões éticos estabelecidos na Declaração de Helsinque de 1964 e suas emendas posteriores. Foi obtido o consentimento informado por escrito dos pais de todas as crianças, e das crianças ≥12 anos, antes da participação. As crianças com TDAH foram recrutadas em ambulatórios de saúde mental, através da associação de pais de crianças com problemas de comportamento e através de um site de pesquisa universitária. O grupo TD foi recrutado a partir de escolas primárias localizadas em todo o país. As crianças com medicamentos estimulantes interromperam o uso de drogas um dia antes da participação (dia 0), para garantir uma lavagem completa, e durante a avaliação da ingestão de sangue, urina e alimentos (dia 1 ao dia 3). No dia 1 a mancha de sangue foi coletada de manhã cedo, para descartar os efeitos da variação diurna das concentrações de AAA no sangue. No mesmo dia, após o horário escolar, a coleta de urina começou e continuou durante as 18 horas seguintes, até a criança retornar à escola na manhã seguinte (dia 2). No início da manhã do dia 1 os pais receberam instruções detalhadas sobre como preencher o registro dietético e como coletar urina de sua criança. Após as instruções, os pais começaram a registrar a ingestão dietética da criança, que continuou nos três dias seguintes (dia 1 ao dia 3). Os pais e professores foram convidados a preencher os questionários em um site seguro. Todos os dados foram recolhidos entre Fevereiro de 2013 e Julho de 2014. O grupo ADHD e TD foram recrutados simultaneamente, para controlar os possíveis efeitos sazonais no consumo alimentar ou no metabolismo AAA.
Análise de dados
Todas as análises estatísticas foram realizadas usando R, versão 3.2.1. Todas as variáveis foram inspecionadas em outliers e valores ausentes para o grupo ADHD e TD separadamente. Winsorising foi aplicado aos outliers, estes foram substituídos por um valor uma unidade maior (ou menor) do que a pontuação mais extrema anterior na distribuição do grupo . Os dados em falta nas concentrações urinárias, dados dietéticos e dados comportamentais foram distribuídos aleatoriamente e substituídos usando meios de grupo. Para as manchas de sangue não havia dados ausentes. Todos os dados foram normalmente distribuídos, exceto os sintomas da DC. As diferenças de grupo no sexo foram examinadas usando um teste de qui-quadrado, e as diferenças de grupo em idade e funcionamento comportamental foram examinadas usando testes t de amostras independentes.
Para testar a primeira hipótese, as diferenças de grupo em concentrações de manchas sanguíneas AAA foram avaliadas usando Análises de Variâncias (ANOVAs) com o grupo (ADHD ou TD) como fator fixo. Os tamanhos dos efeitos foram calculados em termos de eta parcial ao quadrado, e interpretados como pequenos (> .01), médios (>.06) ou grandes (>.14) . Além disso, foram calculados os odds ratios, que expressavam o risco de ser diagnosticado com TDAH com concentrações AAA abaixo da média. Os dados normativos para concentrações de AAA foram derivados de uma grande amostra de crianças de 6 a 13 anos (N = 104, 52% do sexo masculino) (dados não publicados, informações da amostra e resultados disponíveis dos autores). Para cada AAA, foram utilizadas concentrações correspondentes ao menor percentil 16 (M-1 SD) da amostra normativa como valor limiar para definir concentrações de AAA abaixo da média (para triptofano 45 μmole/L, tirosina 39 μmole/L e fenilalanina 47 μmole/L). Os índices de probabilidade foram calculados com intervalo de confiança de 95% e o Teste Exato de Fisher foi realizado para examinar a significância dos índices de probabilidade.
Para testar a segunda hipótese, os coeficientes de correlação produto-momento de Pearson investigaram a relação entre as concentrações de AAA da mancha sangüínea e os sintomas de TDAH, tanto para os pais quanto para o professor. A magnitude dos coeficientes de correlação foi interpretada como pequena (>.10), média (>.30) ou grande (>.50) . Os dados do grupo TDAH e do grupo TD foram combinados para maximizar a variabilidade nas medidas dos sintomas de TDAH.
Para testar a terceira hipótese, foram realizadas análises de correlação entre as concentrações de AAA da mancha sangüínea e a ingestão de proteínas e as concentrações de AAA urinários em toda a amostra. Também examinamos se houve diferenças de grupo na ingestão de proteínas e concentrações urinárias de AAA usando ANOVAs com grupo (ADHD ou TD) como fator fixo. Finalmente, análises correlacionais avaliaram se as concentrações de AAA na mancha sangüínea estavam relacionadas a sintomas de distúrbios psiquiátricos comorbidos relatados por pais e professores (coeficientes de correlação produto-momento de Pearson para ODD e ASD, coeficientes de correlação de Spearman para DC). Se foram encontrados sintomas de ODD, DC ou ASD relacionados com as concentrações de AAA, as análises anteriores foram reexecutadas com esses sintomas inseridos como covariantes. Para corrigir para testes múltiplos, o nível alfa das análises de correlação foi ajustado de acordo com o procedimento de Bonferroni por domínio de resultado; sintomas de TDAH (12 análises, portanto p = .004), potenciais determinantes de anormalidades AAA em manchas de sangue (12 análises, portanto p = .004), e sintomas de distúrbios psiquiátricos comorbidos (18 análises, portanto p = .003). Os resultados ajustados de Bonferroni são relatados.