Objectivos:

1. Para diferenciar entre as duas principais categorias de bactérias: Gram positivo e Gram negativo.
2. Para entender como a reação de coloração de Gram afeta as bactérias Gram positivas e Gram negativas com base nas diferenças bioquímicas e estruturais de suas paredes celulares.

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Coloração é uma técnica auxiliar usada em técnicas microscópicas usadas para aumentar a nitidez da imagem microscópica.Manchas e corantes são amplamente utilizados no campo científico para realçar a estrutura das amostras biológicas, células, tecidos etc.

O procedimento de coloração mais amplamente utilizado em microbiologia é a coloração Gram, descoberta pelo cientista e médico dinamarquês Hans Christian Joachim Gram em 1884. A coloração de Gram é uma técnica de coloração diferencial que diferencia as bactérias em dois grupos: gram-positivos e gram-negativos. O procedimento é baseado na capacidade dos microrganismos de reter a cor das colorações utilizadas durante a reação de coloração de gram. As bactérias gram-negativas são descoloridas pelo álcool, perdendo a cor da coloração primária, púrpura. As bactérias gram-positivas não são descoloridas pelo álcool e permanecerão como púrpura. Após a etapa de descoloração, uma contra-mancha é usada para dar uma cor rosa aos organismos gram-negativos descoloridos.

Fig: Hans Christian Joachim Gram

Importância de uma coloração de Gram:

A coloração de Gram é um passo preliminar muito importante na caracterização e classificação inicial das bactérias. É também um procedimento chave na identificação de bactérias com base nas características de coloração, permitindo que as bactérias sejam examinadas usando um microscópio de luz. As bactérias presentes em um esfregaço não manchado são invisíveis quando vistas com um microscópio de luz. Uma vez coradas, a morfologia e a disposição das bactérias também podem ser observadas. Além disso, é também um passo importante na triagem de agentes infecciosos em amostras clínicas, como esfregaços diretos de um paciente.

O procedimento de coloração de Gram permite que as bactérias retenham a cor das manchas, com base nas diferenças nas propriedades químicas e físicas da parede celular.

1. Bactérias Gram positivas: Púrpura escuro devido à retenção do corante primário chamado Crystal Violet na parede celular.

Exemplo: Staphylococcus aureus

Fig: Bactérias Gram positivas

2. Bactérias de Gram negativo: Vermelho manchado ou rosa devido à retenção do corante chamado Safranin.

Exemplo: Escherichia coli

Fig: Bactérias Gram negativas

Morfologia bacteriana:

As bactérias são microorganismos unicelulares muito pequenos, omnipresentes na natureza. São micrómetros (1µm = 10-6 m) de tamanho. Possuem paredes celulares compostas de peptidoglicano e reproduzem-se por fissão binária. As bactérias variam nas suas características morfológicas.

As morfologias mais comuns são:

Coccus (pleural: Cocci):

Bactérias esféricas; podem ocorrer em pares (diplococos), em grupos de quatro (tetracocos), em cachos semelhantes a uvas (Staphylocococci), em cadeias (Streptococci) ou em arranjos cúbicos de oito ou mais (sarcinae).

Por exemplo: Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes

Bacillus (pleural: Bacilli):

Bactérias em forma de vara; geralmente ocorrem isoladamente, mas podem ocasionalmente ser encontradas em pares (diplo-bacilos) ou em cadeias (estreptobacilos).

Por exemplo: Staphylocococcus aureus, Streptococcus pyogenes

Por exemplo: Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes

Bacillus cereus, Clostridium tetani

Spirillum (pleural: Spirilla):

Bactérias em forma de espiral

Por exemplo: Espécies Spirillum, Vibrio, Spirochete.

Algumas bactérias têm outras formas como:

Coccobacilli: Forma alongada esférica ou ovóide.

Filamentosa: Bacilos que ocorrem em cadeias longas ou fios.

Fusiforme: Bacilos com extremidades afuniladas.

Fig: Morfologia bacteriana diferente

Mecanismos de coloração de grama:

Parede celular positiva de grama:

As bactérias gram-positivas têm uma parede celular de malha espessa que é composta por peptidoglicano (50-90% da parede celular), que mancha de púrpura. O peptidoglicano é principalmente um polissacarídeo composto por duas subunidades chamadas N-acetil glucosamina e N-acetil ácido murâmico. À medida que se formam as camadas adjacentes de peptidoglicano, elas são ligadas transversalmente por cadeias curtas de peptídeos por meio de uma enzima transpeptidase, resultando na forma e rigidez da parede celular. A espessa camada de peptidoglicano dos organismos Gram-positivos permite que estes organismos retenham o complexo cristalino de iodo violeta e manchem as células como roxo.

Ácido Lipoteico (LTA) é outro componente importante da parede celular das bactérias Gram-positivas que está embutido na camada de peptidoglicano. Consiste em ácidos teicóicos que são longas cadeias de fosfato de ribitol ancoradas na camada lipídica através de um glicerídeo. Actua como regulador das enzimas da parede autolítica (muramidases: Enzimas bacterianas localizadas na parede celular que causam desintegração da célula após lesão ou morte.)

Relevância Médica da Parede Celular Gram Positiva:

LTA também tem propriedades antigênicas que estimulam respostas imunológicas específicas quando é liberada da parede celular após a morte da célula. A morte celular é causada por lise induzida por atividades lisozimáticas, peptídeos catiônicos de leucócitos, ou antibióticos beta-lactâmicos.

Parede celular negativa de Gram:

As bactérias gram-negativas têm uma camada mais fina de peptidoglicano (10% da parede celular) e perdem o complexo de iodo violeta cristalino durante a descoloração com o enxágüe com álcool, mas retêm a contra-mancha Safranin, parecendo assim avermelhada ou rosa. Eles também têm uma membrana externa adicional que contém lipídios, que é separada da parede celular por meio do espaço periplasmático.

Relevância Médica da Parede Celular de Gram-Negativo:

A parede celular das bactérias Gram-negativas é muitas vezes um fator de virulência que permite que as bactérias patogênicas causem doenças. A virulência das bactérias Gram-negativas é frequentemente associada com certos componentes da parede celular, em particular, o lipopolissacarídeo (também conhecido como LPS ou endotoxina). Em humanos, o LPS provoca uma resposta imune inata caracterizada pela produção de citocinas e ativação do sistema imunológico. A inflamação ocorre como resultado da produção de citocinas, que também pode produzir toxicidade do hospedeiro.

Reacção de manchas:

Os quatro passos básicos da coloração Gram são:

1) Aplicação da coloração primária Crystal Violet (CV) a um esfregaço de cultura bacteriana fixado a quente.

CV dissocia-se em soluções aquosas em CV+ e iões Cl. Estes dois iões penetram então através da parede e membrana celular das células Gram-positivas e Gram-negativas. Os íons CV+ interagem posteriormente com componentes bacterianos carregados negativamente e mancham as células bacterianas de cor púrpura.

2) Adição de Iodo de Gram.

Iodo (I – ou I3 -) age como um mordente e como um agente de aprisionamento. Um mordente é uma substância que aumenta a afinidade da parede celular por uma mancha ligando-se à mancha primária, formando assim um complexo insolúvel que fica preso na parede celular. Na reação da coloração Gram, o violeta cristal e o iodo formam um complexo insolúvel (CV-I) que serve para tornar a mancha uma cor púrpura escura. Nesta fase, todas as células vão ficar roxas.

3) Descoloração com álcool etílico 95%.

Álcool ou acetona dissolve a membrana externa lipídica das bactérias Gram negativas, deixando assim a camada de peptidoglicano exposta e aumentando a porosidade da parede celular. O complexo CV-I é então lavado da fina camada de peptidoglicanos, deixando as bactérias Gram negativas incolores.

Por outro lado, o álcool tem um efeito desidratante sobre as paredes celulares das bactérias Gram positivas, o que faz com que os poros da parede celular encolham. O complexo CV-I fica fortemente ligado à parede celular de Gram positivo em várias camadas, altamente reticulado, corando assim as células de cor púrpura.

A etapa de descoloração deve ser realizada com cuidado, caso contrário pode ocorrer uma descoloração excessiva. Esta etapa é crítica e deve ser cronometrada corretamente, caso contrário a coloração de cristal violeta será removida das células Gram-positivas. Se o agente descolorante for aplicado na célula por muito tempo , os organismos Gram-positivos aparecerão Gram-negativos. A sub-decolorização ocorre quando o álcool não é deixado ligado o tempo suficiente para lavar o complexo CV-I das células Gram-negativas, resultando no aparecimento de bactérias Gram-negativas Gram-positivas.

4) Contra-mancha com Safranina

As células Gram-negativas descoloridas podem se tornar visíveis com uma contra-mancha adequada, que geralmente é safranina com carga positiva, que as mancha de rosa. A cor rosa que adere às bactérias Gram positivas é mascarada pelo roxo do violeta cristal (o fuschin básico é por vezes utilizado em vez do safranin em situações raras).