Mecanismo de despolimerização sinérgica do filamento sinérgico de actina por proteína associada ao ciclo e cofilina

DNA constrói

Todas as proteínas N-CAP do rato, N-CAP-GFP, CAP1 de comprimento total, o domínio HFD, a fusão GST do domínio HFD e o domínio C-terminal ADF-H de twinfilin, foram clonados no vector de expressão bacteriana pSUMOck4 (uma espécie de presente de Inari Kursula, Universidade de Bergen, Noruega) para exprimir uma proteína de fusão com marcação SUMO que deixa um N-terminus nativo após a clivagem com protease SENP2. Para o domínio CARP e as construções C-CAP, utilizamos o vector de expressão bacteriana pCoofy18 (uma espécie de presente da Addgene). Para detalhes das construções proteicas e primers usados para clonar as construções, ver Tabela Suplementar 2.

Proteínas CAP de expressão e purificação e seus fragmentos

Todas as proteínas CAP de rato e seus fragmentos, excepto CAP1 de comprimento total, foram expressos a +22 °C em meios de auto-indução LB (AIMLB0210, Formedium) durante 24 h em BL21(DE3) E. coli (de Novagen).

Mouse CAP1 de comprimento total foi expresso em meio LB usando células ArcticExpress (DE3) E. coli. Primeiro, inoculamos uma cultura inicial contendo canamicina (20 µg/ml) e gentamicina (20 µg/ml) que foi incubada durante 6 h a +37 °C. A cultura principal 3,6-l, contendo apenas canamicina (20 µg/ml), foi inoculada e cultivada até OD600 de ~0,4 a +37 °C, agitando a 240 rpm. A temperatura de cultivo foi alterada para +13 °C durante 1 h antes da expressão da proteína que foi induzida pela adição de 0,26 mM IPTG durante 46 h. Todas as pastilhas bacterianas foram coletadas por centrifugação, ressuspendidas em 50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 25 mM imidazol, pH 7,5, congeladas com líquido N2 e armazenadas a -80 °C.

Todas as proteínas CAP e o domínio ADF-H de twinfilin foram purificadas usando um fluxo de trabalho similar. Primeiro, as bactérias foram lisadas por sonicação na presença de lisozima (0,5 mg/ml), DNAse (0,1 mg/ml) e inibidores de protease (200 µg/ml de PMSF, 1 µg/ml de leucopetina, 1 µg/ml de aprotinina, 1 µg/ml de pepstatina A; todas de Sigma-Aldrich), e o lisado foi clarificado por centrifugação. O sobrenadante foi carregado em uma coluna HisTrap HP Ni-NTA de 1 ml (GE Healthcare) e lavado extensivamente (>20 volumes de coluna) com 50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 25 mM imidazol, pH 7,5. A proteína foi eluida por 25-250 mM de imidazol no aparelho AKTA Pure (GE Healthcare). As frações de pico foram agrupadas e a protease SENP2 foi adicionada à concentração final de 40 µg/ml para remoção da SUMO-tag. A mistura foi dialisada O/N a 4 °C utilizando tubos de diálise SnakeSkin em 1 l de 20 mM HEPES, 300 mM NaCl, 2 mM DTT, tampão pH 7,4. No dia seguinte, as etiquetas SUMO clivadas foram removidas com contas de agarose Ni-NTA (Qiagen) nos casos em que a etiqueta SUMO e a proteína clivada eram de tamanho igual. As proteínas foram concentradas com o filtro centrífugo Amicon Ultra-4 10 kDa (Merck) e carregadas na coluna de filtração HiLoad 16/600 Superdex 200 gel (GE Healthcare) equilibrada em 5 mM HEPES, 100 mM NaCl, 1 mM DTT, pH 7,4. As frações de pico foram coletadas, concentradas e congeladas por congelamento instantâneo em N2 para armazenamento a -80 °C.

O CAP de comprimento total foi purificado com as seguintes exceções. Utilizamos uma coluna HisTrap HP Ni-NTA de 5 ml em vez de uma coluna de 1 ml. Após diálise e filtração em gel com a coluna de filtração HiLoad 16/60 Superdex 200 gel, as maiores frações de pico foram passadas através da coluna de filtração Superose 6, aumentando 10/300 GL gel para obter uma melhor separação da mistura de estados oligoméricos. Finalmente, os picos principais de várias corridas foram combinados, concentrados em intervalos de 5 minutos com o filtro centrífugo Amicon Ultra-4 30 kDa, e armazenados como acima. As proteínas CARP e C-CAP foram purificadas como acima com exceção do uso de protease 3C (0,01 mg/ml) para clivagem de tag.

Outras proteínas

Atina muscular Rabbit, actinas rotuladas, profilina, cofilina-1 de camundongo, proteína de nivelamento, e biotina-gelolina foram preparadas como descrito na ref. 16. A ADP-actin foi preparada como descrito na ref. 16. 34. Em resumo, 30 µM de solução de ATP-G-actina contendo 0,3 mM de glucose e 1 unidade/ml de hexoquinase (Sigma) foi dialisada contra o tampão de troca de nucleotídeos (5 mM Tris-HCl, 0,1 mM MgCl2, 0,05 mM EGTA, 0,2 mM ADP, 1 mM DTT, pH 8,0) durante 4 h a 4 °C. Todos os experimentos foram realizados utilizando o músculo do coelho α-actin.

Actin pointed end depolymerization assays

A medição da taxa de despolimerização ponta a ponta do filamento de actina foi realizada utilizando um dispositivo microfluídico emparelhado a um conjunto de microscopia, conforme descrito16. Em resumo, preparamos uma câmara com polidimetil siloxano (PDMS, Sylgard), que foi montada sobre uma lamela limpa. As câmaras microfluídicas tinham 20 µm de altura. As três entradas e a saída foram conectadas a tubos de pressão controlada preenchidos com soluções de composição bioquímica diferente (dispositivo de microfluidos fluentes).

Após a montagem, as câmaras foram enxaguadas com dH20 e tampão F (5 mM HEPES pH 7,4, 100 mM KCl, 1 mM MgCl2, 0,2 mM EGTA, 0,4 mM CaCl2, 0,2 mM ATP, 10 mM DTT e 1 mM DABCO). A câmara foi então exposta sucessivamente: 150 µl de 0,1% de biotin-BSA em tampão F; 300 µl de 5% de BSA; 150 µl de 3 µg/ml de neutravidina em tampão F; e 10-100 µl de 1-3 pM biotin-gelolina. Antes das experiências, os filamentos de actina foram polimerizados (8 µM, >30 min) no tampão F. Uma fração de monômeros de actina foi rotulada com Alexa-488 ou 568. Os filamentos foram finalmente injetados na câmara e ancorados na lamela pelas gelsolinas até a densidade desejada.

Para medir a taxa de despolimerização das extremidades pontiagudas decoradas com cofilina, os filamentos foram primeiro saturados com cofilina 2 µM, e expostos a cofilina 2 µM suplementada com diferentes proteínas CAP. A taxa de despolimerização foi analisada com ImageJ, primeiramente fazendo um kymograph para cada filamento (função reslice) e ajustando manualmente uma inclinação ao longo da extremidade pontiaguda. Filamentos, cujas extremidades pontiagudas não puderam ser claramente rastreadas ou tiveram possíveis pausas (não observadas)53 ou eventos de corte foram descartados da análise.

Para minimizar o efeito da etiqueta proteica em nossas medidas, utilizamos 10% ou 16% de fração rotuladora de actina, dependendo da configuração da microscopia. Não observamos os efeitos da fração de rotulagem da atividade N-CAP em nossos experimentos. Todos os experimentos foram realizados à temperatura ambiente, em configuração sem temperatura controlada.

Reinelamento de filamentos de actina

Soluções pré-formadas, em estado constante de F-actin (em tampão F) com diferentes etiquetas fluorescentes foram misturadas e incubadas a fim de quantificar o recozimento. A solução mista continha 4 µM de Alexa568-actin (10% rotulada) e 4 µM de Alexa488-actin (10% rotulada), com ou sem N-CAP e mutantes. Após 4 min à temperatura ambiente, a solução mista de F-actin foi diluída 100× em tampão suplementado com metilcelulose a 0,2%, e fluiu para uma câmara aberta feita com fita adesiva dupla face colada entre duas lamelas, e passivada com BSA. As séries de imagens (intervalo de 2 s) foram adquiridas em pelo menos três campos de visão diferentes. Foram contados o número de segmentos F-actin verdes (Alexa488), bem como o número destes segmentos que estavam ligados a um segmento F-actin vermelho (Alexa568), a fim de determinar a razão de dois segmentos de cor traçados na Fig. 2f. A monitorização da difusão dos filamentos permitiu-nos determinar sem ambiguidade quando dois segmentos estavam ligados. Os controles (sem N-CAP na mistura F-actin) foram repetidos várias vezes, e os experimentos (com N-CAP ou mutantes) pelo menos duas vezes.

Actin severing assays

Para investigar o impacto do N-CAP no corte por cofilina, usamos dois métodos diferentes, ou (1) medindo a fração de domínios de cofilina única que ainda não levaram a um corte ou (2) quantificando o número global de eventos de corte por µm de filamento de actina.

(1) Corte associado a domínios de cofilina única (Suplemento Fig. 3c). Seguimos o procedimento descrito anteriormente16. Resumidamente, dentro de uma câmara microfluídica, 12% dos filamentos de actina marcados com Alexa-488 foram polimerizados a partir de sementes de actina espectrina, ancorados de forma não específica a uma lamela de BSA-passivada. Os filamentos foram envelhecidos durante 15 min com uma solução de actina G em concentração crítica (100 nM de actina G), de modo que os filamentos se tornaram >99% ADP46. Os filamentos foram então continuamente expostos a 500 nM mCherry-cofilin-1 sozinhos, com 2 µM CAP1 de comprimento total ou com 10 µM N-CAP. No ImageJ, os kymographs dos filamentos foram então construídos para seguir a nucleação e montagem dos domínios de cofilina simples e eventos de corte na interface com segmentos de actina nua.

Para cada domínio, o tempo 0 foi definido no quadro no qual eles se nuclearam. Em seguida, registramos o tempo em que eles induziram um evento de separação, ou quando eles se perderam devido à separação por outro domínio, fusão, ou evento de censura. A fração de domínios que não induziram um evento de corte foi então calculada usando um método clássico de Kaplan-Meier.

(2) Número total de eventos de corte/µm (Fig. 3d Suplementar). No interior das câmaras de fluxo (entre duas lamelas espaçadas por fita adesiva dupla face, injetamos primeiramente filamentos pré-polimerizados com a marca Alexa-488 (em tampão F, com 0,2-0,3% de metilcelulose). A solução foi então trocada com 500 nM de cofilina-1 e 0, 1 ou 10 µM de NCAP não rotulados. Após a troca, os filamentos que permaneceram próximos à superfície foram analisados da seguinte forma.

O número de eventos de corte por µm foi calculado como a função cumulativa

onde Nsev(u) é o número de eventos de corte no tempo u, e {mathop {\i(u)}nolimits_i {l_{i(u)}} é a soma em todos os filamentos i da sua duração no tempo u. Como a solução não contém G-actin, os filamentos despolimerizam, e o comprimento dos filamentos diminui com o tempo.

Aglutinação de N-CAP a filamentos pontas pontiagudas

O experimento foi realizado em câmaras de fluxo (ver ensaio de corte de Actin (2)), passivado com biotin-PLL-PEG e funcionalizado com neutravidina. F-actin (10% Alexa-568, 1% biotina) foi polimerizado de um dia para o outro a 4 µM. Pouco antes da injeção na câmara, a F-actin foi diluída até 200 nM e misturada com 100 nM N-CAP-GFP, 2 µM de cofilina-1, e 4 nM de proteína de limitação, em tampão F complementada com metilcelulose 0,2%. Imagens de filamentos de actina foram adquiridas antes e depois da aquisição do canal GFP (5 quadros/segundo ao longo de 12 s, microscopia TIRF). Para análise da ligação às extremidades do filamento, os filamentos de actina que não se moveram durante a aquisição do fluxo foram cegamente seleccionados. A fluorescência foi medida nas duas extremidades de cada filamento, em uma área de 3 por 3 pixels. Um evento de ligação foi detectado quando a fluorescência ultrapassou um limiar arbitrário (mesmo valor para todos os filamentos e pontas de filamento). Uma vez que a proteína de limitação deve proteger a extremidade farpada, a extremidade pontiaguda foi atribuída àquela com o maior número de eventos de ligação. N-CAP-GFP foi detectado em 17% dos pontos de dados na extremidade ponta do filamento, enquanto a associação inespecífica de N-CAP-GFP na vizinhança da extremidade barbada do filamento foi detectada em 1,7% dos pontos de dados. A fração de sobrevivência do N-CAP na extremidade pontiaguda foi então calculada e ajustada com um único exponencial para medir a taxa de desbobinamento.

Crystallization and structure determination

O domínio HFD do mouse foi cristalizado com 10×His-tag presente, e purificado como descrito acima, com exceção do uso de 5 mM HEPES, 50 mM NaCl, 0,2 mM DTT, 0,01% NaN3, tampão de pH 7,5 na filtração em gel. A amostra foi concentrada a 7-10 mg/ml antes da cristalização e misturada 1:1 a 0,1 M de cacodilato de sódio, 12% de PEG4000 (p/v), pH 6,1 em um método de gota sentada com tamanho de gota de 200 nl em formato de 96 poços. Após 2 semanas de incubação, foram observados grandes cristais em forma de agulha. Para a recolha remota de dados na Diamond Light Source (Reino Unido, Didgot) na linha de feixe I03, os cristais foram protegidos crio-protegidos por imersão em líquido mãe contendo 25% de glicerol e congelados em N2 para envio para a linha de feixe. Os dados foram recolhidos a 100 K usando 0,9763 Å comprimento de onda, detector Pilatus3 6M, 30% de potência de transmissão, 0,05 s de exposição e 0,1° de ângulo de oscilação como um total de 2400 fotogramas. Os dados de difração foram integrados e escalonados com o software X-ray Detector Software (XDS)54. A solução inicial foi obtida com substituição molecular usando PHASER55 e PDB = 1s0p como modelo de busca. Uma solução com quatro domínios HFD presentes numa unidade assimétrica foi encontrada, após o que múltiplas rondas de refinamento com BUSTER56 e a construção manual em COOT57 permitiram um bom ajuste aos dados (ver Tabela 1). Melhorias adicionais foram obtidas através do refinamento dos dados com a introdução de parâmetros de parafuso de translação-liberação (1/chain), remoção de restrições não cristalográficas e modelagem individual do fator B atômico. O Rwork/Rfree final para o modelo foi 18,6%/23,0% com boa geometria geral.

Para cristalização do complexo tripartido (de ADP-actin, domínio HFD do mouse CAP1, e C-terminal ADF-H do mouse twinfilin-1), ADP-actin foi preparado em diálise O/N a +4 °C em 5 mM HEPES, 0.2 mM MgCl2, 0.2 mM ADP, 0.2 mM EGTA, 0.3 mM glucose, 0.5 mM β-mercaptoetanol, pH 8.0. A solução actina, contendo glicose 0,3 mM e 5 U/ml de hexoquinase, foi transferida para uma membrana de diálise Slide-A-Lyser e colocada em um dispositivo de flutuação a +4 °C. No dia seguinte antes da formação complexa, a actina foi centrifugada durante 20 min a 355,040 × g com rotor TLA-120. As proteínas foram misturadas na proporção 1:1.1:1.1 (actina, domínio HFD, domínio ADF-H), concentradas a 10-20 mg/ml e usadas para cristalização como acima. Os batimentos foram obtidos em várias condições diferentes, e o melhor cristal difrator foi obtido com ~10 mg/ml de concentração do complexo misturado 1:1 em 0,1 M HEPES, 0,1 mM KCl, 10% PEG4000 (p/v), pH 7,0 com tamanho de gota sentada de 200 nl. No primeiro dia, vários pequenos cristais em forma de diamante apareceram na gota. No terceiro dia, um cristal grande em forma de bastão apareceu enquanto todos os cristais pequenos foram dissolvidos. Para a coleta remota de dados na Diamond Light Source (Reino Unido, Didgot) na linha de feixe I03, os cristais foram crio-protegidos por imersão em LV CryoOil (MiTeGen) e congelados em N2 para envio. Os dados foram recolhidos a 100 K usando 0,9762 Å comprimento de onda, detector Pilatus3 6M, 20% de potência de transmissão, 0,05 s de exposição e 0,15° de ângulo de oscilação como um total de 2400 frames. Os dados de difração foram integrados e escalonados com XDS54. Uma solução inicial foi obtida com substituição molecular utilizando PHASER55 e PDB = 3daw como modelo de busca que mostrou clara densidade extra na extremidade pontiaguda do monômero actina. Assim, foi realizada outra substituição molecular, tendo sido obtido um modelo inicial para o complexo tripartido utilizando BALBES58 com 3daw e 1s0p como modelos de pesquisa. Isto produziu uma solução com Q = 0,787 e Rwork/Rfree = 29,7%/35,6%. A unidade assimétrica continha um único complexo 1:1:1 de HFD:ADF-H:ADP-actin. Múltiplas rondas de refinamento com BUSTER56 e construção manual em COOT57, especialmente a reconstrução do D-loop e das malhas de ligação de α-helices no domínio HFD foram necessárias para melhorar o modelo. Finalmente, adição de águas, introdução de parâmetros de parafuso de translação-libração (1/chain), e modelagem individual do fator B atômico produziu um modelo com Rwork/Rfree final de 16,6%/19,4% com boa geometria geral.

Examinando interações proteína-proteína por filtração de gel

Para o estudo da ligação do monômero actin, o ADP-G-actin foi preparado como descrito na ref. 34. Todos os experimentos de filtração em gel foram realizados a +4 °C com velocidade de 0,5 ml/min e fracionamento de 0,5 ml com a coluna de filtração em gel Superdex 200 com aumento de 10/300 GL, equilibrada em 5 mM HEPES, 100 mM NaCl, 0,1 mM ADP, 0,1 mM MgCl2, 1 mM DTT, pH 7,4. Cem microlitros de complexo contendo 18 µM de domínio ADF-H de twinfilin, 15 µM de outras proteínas foram injetados na coluna e analisados para eluição. Frações de pico também foram analisadas pela SDS-PAGE. Experimentos de competição com monômeros de actina foram realizados como acima, incluindo 15 µM de domínio C-CAP ou CARP para as amostras. As frações de pico foram analisadas em SDS-PAGE, os géis foram imitados com ChemiDoc XRS + sistema de imagem (Bio-Rad), e quantificados usando o Image Lab (Bio-Rad).

Native-PAGE

Mini-Protean TGX 10% gels (Bio-Rad) foram pré-runidos em buffer de execução refrigerado (25 mM Tris, 195 mM glicina, 0.5 mM ADP, 0.1 mM MgCl2, pH 8.5) durante 1 h antes da carga. As amostras foram preparadas em tampão de diálise ADP-actin (5 mM HEPES ou Tris, 0,1 mM MgCl2, 0,1 mM EGTA, 0,2 mM ADP, 0,3 mM glicose, 0,1 mM TDT, pH 8.0) a 20 µM de concentração de cada proteína, misturada a 1:1 com tampão de carga 2× (tampão de execução contendo 20% de glicerol, azul de bromofenol, sem ADP ou MgCl2) e depois aplicando 5 µl de volume em poços de amostra de 50 µl. Gels foram executados a 100 V em gelo por 4 h.

Fluorometric actin filament disassembly assay

The steady-state disassembly of ADP-actin filaments was performed as following: 5% de pirina foi polimerizado em 20 mM HEPES, 100 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 1 mM ATP, 1 mM DTT, pH 7,4 por 60 min. As extremidades do filamento farpado foram cobertas por 50 nM de proteína de nivelamento. Subsequentemente, 0.5 µM cofilina (e 0.5 µM N-CAP) foram adicionados, e a reacção foi iniciada pela adição de 4 µM proteína de ligação à vitamina D (agente sequestrante do monómero). A concentração final de actina foi de 2,5 µM. A desmontagem da actina foi medida seguindo a fluorescência de pireno com excitação a 365 nm e emissão a 407 nm no espectrofotómetro de fluorescência (Agilent) durante 2400 s a 22 °C.

Espectrometria CD

Os espectros CD para o tipo selvagem N-CAP, mutantes e domínio HFD foram medidos a 20 °C com o espectrómetro J-720 (Jasco), em 300 µl de cuvete de quartzo de 0,1 cm de comprimento de percurso de luz com os seguintes parâmetros: continua o modo de varrimento com velocidade de varrimento de 50 nm/min, largura de banda de 0,5 nm, amplitude de onda de 190-260 nm, inclinação dos dados de 0,5 nm. Todas as proteínas foram diluídas até 15 µM com buffer PBS a 10%. A acumulação de dez varreduras para cada proteína foi plotada como uma única curva.

Modelos para simulações atomísticas MD

Os modelos de actina co-decorada foram baseados na estrutura de microscopia crio-eletrônica de resolução 3,8 Å (PDBID: 5YU8)41. Os loops em falta foram construídos usando RosettaCM59 e RosettaScripts60 na presença do mapa de densidade de elétrons41 impondo a simetria helicoidal associada. Para corresponder às construções experimentais neste trabalho, as sequências de actina e cofilina foram, nesta fase, alteradas de galinha para coelho e rato, respectivamente. Mais de 1000 modelos foram gerados. Eles foram então classificados com base em sua pontuação total e os que continham artefatos estruturais (por exemplo, ligações cis peptídeos) foram filtrados. As simulações de dinâmica molecular (MD) foram iniciadas a partir dos três modelos com pontuação mais alta (Tabela Suplementar 1, simulações F1-3).

O complexo HFD-actin foi isolado do complexo de domínio HFD/actin/twinfilin ADF-H cristalizado e acoplado separadamente aos modelos de filamento de actina co-decorados selecionados descritos acima. Para este fim, a actina HFD isolada foi sobreposta a cada monômero de actina ponta, que foi então substituída pela actina HFD. Desta forma, a conformação da estrutura cristalina do dímero de actina HFD é transferida para a ponta da actina co-decorada. Os modelos ancorados foram primeiramente refinados localmente usando o protocolo de ancoragem61 seguido por um relaxamento restrito com o protocolo de relaxamento rápido62 distribuído com o Software Suite Rosetta. Este processo foi aplicado separadamente para cada filamento de actina co-decorada selecionado para simulações MD (Tabela Complementar 1, simulações C1-3).

Construção do segmento extremo pontiagudo para simulações MD

Cada simulação foi realizada em um segmento extremo pontiagudo do modelo de filamento de actina co-decorada selecionado, que foi criado cortando o modelo perpendicularmente ao eixo do filamento. O plano do corte foi escolhido de modo que quatro monômeros de actina atados ADP-Mg2+ inteiros, e três monômeros de cofilina inteiros foram incluídos dentro do segmento (Tabela Suplementar 1, simulações F1-3). O segmento também continha os dois domínios do DAF na extremidade pontiaguda nos sistemas de delimitação do DAF (Tabela Complementar 1, simulações C1-3). O segmento de extremidade pontiaguda também continha vários fragmentos de polipeptídeos de cofilinas e actinas na sua extremidade farpada (Suplemento Fig. 5a). Para manter sua conformação e posição durante as simulações, essas cadeias quebradas foram mantidas em posição retidas durante as simulações como segue: Uma camada de resíduos na interface com o resto do segmento da ponta foi deixada livre; todos os átomos pesados perto do plano de corte e apenas os átomos pesados da espinha dorsal para as regiões intermediárias foram retidos com uma constante de força de 100 kJ/mol/nm2 (Suplemento Fig. 5a). Estes fragmentos de polipéptidos parcialmente retidos na extremidade farpada actuam como uma plataforma durante as simulações. Esta abordagem mantém tanto a interface proteína-proteína do filamento na extremidade farpada quanto a orientação do filamento durante as simulações.

Os estados de protonação dos resíduos foram determinados no pH neutro com base em cálculos de pKa usando PROPKA363. Cada resíduo de actina H73 foi metilado (Nτ-Methyl-l-histidine, HIC), e os N-termini de actina, cofilina, e HFD foram acetilados. As topologias para cada molécula nos sistemas foram preparadas com o programa LeAP distribuído com ambertools1864, que foram então convertidas para o formato GROMACS usando a ferramenta ParmEd.

Cada fatia de ponta criada a partir dos modelos selecionados foi colocada em uma caixa de simulação do prisma hexagonal com seu eixo longo alinhado com o eixo z. As dimensões da caixa foram escolhidas para ter uma distância mínima de cerca de 17 Å entre o filamento e cada face da caixa (Tabela Complementar 1). Cada sistema foi solvado com solução de NaCl 0,15 M com o número de íons ajustado para neutralizar o sistema.

Antes da produção, foram realizadas as mais íngremes simulações de descida e sucessivas simulações de equilíbrio curto (no total ~7 ns) nos conjuntos NVT e NpT utilizando o termostato e barostato de Berendsen65. Foram aplicadas restrições posicionais harmônicas à fatia final pontiaguda durante essas simulações de equilíbrio. Um grupo menor de átomos (todos os átomos pesados, a espinha dorsal da proteína e finalmente apenas os átomos Cα) foram restringidos em cada simulação de equilíbrio consecutiva com uma constante de força de 1000 kJ/mol/nm2.

Os sistemas que foram ramificados dos outros (Tabela Suplementar 1; C1′, C2′. F2′) foram preparados fazendo a modificação adequada (acoplando ou removendo domínios HFD), removendo as moléculas de solvente sobrepostas (quando os domínios HFD foram acoplados), e reajustando o tamanho da caixa e os átomos de solvente para o novo tamanho do sistema. O equilíbrio faseado de NVT e NpT com restrições foi realizado como mencionado acima (no total ~200 ps para simulações onde os domínios HFD foram removidos, e no total ~4 ns onde está acoplado).

Todas as execuções de produção foram realizadas para 1-2.5 μs no conjunto NpT com apenas as restrições posicionais acima mencionadas na região da plataforma.

Campos de força e parâmetros nas simulações MD

Os seguintes campos de força e conjuntos de parâmetros foram empregados nas simulações MD: Âmbar ff14sb66 para as proteínas, modelo TIP3P67 para água, o parâmetro de íon monovalente definido por Joung e Cheatham68 para Na+ e Cl-, um modelo de íon octaédrico multisite por Saxena e Sept69 para Mg2+, e um parâmetro de composto polifosfórico definido por Meagher et al.70 para ADP. Parâmetros ligados em falta para metil-histidina (Nτ-Methyl-l-histidine, HIC) foram adotados a partir do campo de força GAFF264. As cargas atômicas foram calculadas seguindo o protocolo por Duan et al.71 O software R.E.D.III.572 foi empregado para o ajuste de potencial eletrostático retido por multiconformação (RESP) usando uma conformação estendida e um α-helical do dipeptídeo HIC (Ace-HIC-Nme). Todos os cálculos quântico-químicos foram realizados utilizando o conjunto de programas Gaussian0973 no nível da teoria b3LYP/cc-pVTZ. Os cálculos de carga foram realizados com o modelo IEFPCM em um contínuo polarizável com uma constante dielétrica de 4, definindo o solvente como éter.

Protocolos de simulação MD

Todas as simulações foram realizadas utilizando o GROMACS 2018 74. As equações de movimento foram integradas usando um algoritmo de salto de sapo com um passo de tempo de 2 fs. Todas as ligações foram restringidas usando o algoritmo LINCS75. Os protocolos de simulação foram escolhidos de acordo com a ref. 66. Interações eletrostáticas de longo alcance foram tratadas pelo esquema Ewald de malha lisa de partículas76 com um corte de espaço real de 0,8 nm, um espaçamento de Fourier de 0,12 nm, e uma interpolação de quarta ordem. O potencial Lennard-Jones com um corte de 0,8 nm foi utilizado para interações van der Waals. Correções de dispersão de longo alcance foram aplicadas para energia e pressão77,

Todas as simulações de produção foram realizadas no conjunto NpT. A fatia final pontiaguda, a plataforma e o solvente (água e NaCl 0,15 M) foram acoplados a banhos de temperatura separados a 310 °K usando o termostato Nosé-Hoover78,79 com uma constante de tempo de 1,0 ps. O acoplamento de pressão isotrópica foi realizado usando o barostato Parrinello-Rahman80 com uma pressão de referência de 1 atm, uma constante de tempo de 5 ps, e uma compressibilidade de 4,5 × 10-5 bar-1,

Análise das simulações MD

Todas as análises foram realizadas usando o VMD81 e scripts internos. Os cálculos da MMGBSA foram realizados utilizando o software MMPBSA.py82 distribuído com ambertools1864 utilizando o modelo modificado de GB desenvolvido por Onufriev et al.83 com concentração de sal de 0,15 M (quadros amostrados a cada 100 ns descartando os primeiros 500 ns de cada simulação).

Análises estruturais

Para análise das diferentes estruturas de actina e seus estados conformacionais apresentados na Fig. 1d, seguimos o protocolo de Tanaka et al.41,84. usando a estrutura F-actin (PDB 6djo) como referência.

Análise estatística e reprodutibilidade

Dados nas Figs. 2d, 4b e 4d foram agrupados a partir de vários experimentos realizados em diferentes dias, representando assim dados de vários experimentos independentes. Os painéis 2f, 2g, 2h e 3d apresentam dados analisados de um único experimento representativo. n descreve o número de filamentos analisados para os painéis 2d, 2f, 2g, 4b e 4d. n no painel 6c corresponde ao número de vezes que o experimento foi realizado.

Experimentos nas Figuras Suplementares. 2a-d, 3c, 6a-d foram realizados com resultados semelhantes pelo menos duas vezes. Os experimentos em 3d, o experimento de competição no domínio CARP em 6a, e os experimentos em condições de promoção de montagem na Fig. 7 foram realizados uma vez.

Síntese do relatório

Outras informações sobre o desenho da pesquisa estão disponíveis no Nature Research Reporting Summary ligado a este artigo.