In vivo RyR1 redução muscular desencadeia uma miopatia tipo núcleo

Geração do RyR1Flox/Flox::Modelo de rato HSA-Cre-ERT2

Uma linha de rato com sítios loxP inseridos em ambos os lados dos exões 9-11 do gene RYR1 (assim chamado RyR1Flox/Flox) foi cruzada com a linha de rato HSA-Cre-ERT2 expressando a recombinase Cre-ERT2 dependente do tamoxifeno sob o controlo do músculo esquelético humano α-actin gene , para criar RyR1Flox/Flox::HSA-Cre-ERT2. A injeção de Tamoxifen induz a ativação da recombinase de Cre-ERT2 seletivamente no músculo esquelético, o que resulta na deleção dos exons 9-11 e ruptura do gene RYR1 no músculo esquelético com estrita dependência de tamoxifen (Fig. 1a). Ao nascimento, os ratos RyR1Flox/Flox::HSA-Cre-ERT2 estavam normais, e aos 2 meses de idade, uma vez adultos jovens, a recombinação foi induzida pela injeção de tamoxifeno (a partir deste momento, os animais recombinados foram chamados de RyR1-Rec). As conseqüências moleculares e fisiológicas foram estudadas em função do tempo, até 105 dias após a indução da recombinação (Fig. 1b). Os animais de controle (CTRL) são animais de cama RyR1Flox/Flox (sem o transgene HSA-Cre-ERT2) injetados com tamoxifen. O fenótipo geral dos ratos recombinados aos 75 dias é caracterizado por uma cifose associada a uma mobilidade anormal dos membros posteriores e a uma marcha com bambolear. Os animais ainda são capazes de ficar de pé nas patas traseiras para se alimentarem, mas as pastilhas de comida foram sistematicamente dadas directamente na gaiola à medida que a doença avançava. Aos 105 dias, os animais ainda são móveis em suas gaiolas e não se observou aumento da taxa de mortalidade em comparação com a CTRL. Tanto os machos como as fêmeas foram afectados. A quantidade relativa de RyR1 ao nível do mRNA foi analisada no músculo quadríceps a cada 15 dias após a recombinação utilizando RT-q-PCR em CTRL e em animais RyR1-Rec (Fig. 1c). Uma queda rápida do mRNA do RyR1 foi observada, com um nível baixo e estável de 21% ± 4% do valor inicial alcançado logo 3 dias após a injeção do tamoxifeno. Foi observada uma redução em todos os músculos testados 75 dias após a indução de recombinação (Quadriceps, tibialis anterior, EDL, soleus, arquivo adicional 1: Fig. S1A). A quantidade de proteína RyR1 foi analisada posteriormente, utilizando o Western blot quantitativo nos homogeneizados do músculo quadríceps (Fig. 1d, e). Esta quantidade foi progressivamente reduzida e atingiu cerca de 50% do valor inicial após 105 dias. Nenhuma redução adicional na proteína RyR1 foi observada em tempos mais longos (dados não mostrados). A quantidade de proteína RyR1 foi quantificada em diferentes homogeneizações musculares 75 dias após a recombinação. Uma redução foi observada em todos os músculos ensaiados, embora a quantidade restante tenha diferido ligeiramente entre os músculos, sendo a maior em interósseo (64% ± 5%) e a menor em sola (33% ± 5%) (arquivo adicional 1: Fig. S1B).

RyR1-Rec ratos mostram redução progressiva no peso muscular e corporal e na força muscular

As consequências da redução de RyR1 foram estudadas pela primeira vez a nível de todo o animal. Inicialmente com o mesmo peso, os animais CTRL ganharam peso lentamente de 24,4 ± 0,4 a 30,6 ± 0,8 g em D90, enquanto os animais RyR1-Rec perderam peso progressivamente para 20,6 ± 1,3 g em D90 (Fig. 2a). Tanto machos como fêmeas foram afetados e perderam cerca de 13% do seu peso corporal inicial após 75 dias (arquivo adicional 1: Fig. S1C). Isto é o resultado de uma perda de peso observada em todos os músculos (arquivo adicional 1: Fig. S1D). Para testar o desempenho muscular global após a redução do RyR1, os animais foram submetidos a dois testes de força diferentes. Primeiro, foi-lhes permitido pendurar-se numa superfície com as quatro patas cruzadas até 5 min, reflectindo a latência da queda da força muscular. O teste de aderência realizado semanalmente durante 105 dias (Fig. 2b) mostrou que os animais RyR1-Rec começaram a perder força 20-30 dias após a injeção de tamoxifen, quando a quantidade de RyR1 era de cerca de 75-80% do seu valor inicial, não podendo ser pendurados na grade cerca de 75 dias após a injeção de tamoxifen, já que a quantidade de RyR1 tinha atingido o nível de cerca de 60%. A força muscular também foi avaliada por um protocolo de 6 minutos de electroestimulação não invasiva do músculo gastrocnémico acoplado à ressonância magnética anatómica (RM) sob anestesia geral. Durante o protocolo de eletroestimulação dos animais CTRL 30 dias após a injeção do tamoxifeno (Fig. 2c, D30) foi registrado um perfil de exercício típico, com uma força muscular inicial estável que diminuiu lentamente com a fadiga muscular. No grupo CTRL em D60 e D90 o perfil de exercício mostrou melhora da força muscular quando os animais ficaram mais velhos (Fig. 2c). Em contraste, o desempenho dos animais RyR1-Rec, semelhante ao CTRL em D30, deteriorou-se com a idade. Os animais RyR1-Rec não puderam mais realizar o exercício em D90 (Fig. 2c, RyR1-Rec D90). O volume de Gastrocnemius medido com imagens RM (Fig. 2d) permaneceu estável em animais CTRL de D30 (161 ± 5 mm3) a D90 (164 ± 4 mm3). Em contraste, em ratos RyR1-Rec, o volume gastrocnêmio foi significativamente menor do que em ratos CTRL desde D30 (141 ± 3 mm3, p = 0,003), e foi reduzido ainda mais para 100 ± 3 mm3 em D60 (p < 0,001 em relação a CTRL na mesma idade) e 69 ± 4 mm3 em D90 (p < 0,001 em relação a CTRL na mesma idade). A tensão de contração específica máxima (tensão de contração absoluta normalizada ao volume muscular) confirma que ambos os grupos apresentaram força muscular semelhante em D30 (Fig. 2e), mas a força dos animais RyR1-Rec diminuiu drasticamente enquanto que aumentou nos animais CTRL à medida que envelheciam. Além disso, as alterações na bioenergética muscular gastrocnêmica durante a eletroestimulação foram avaliadas de forma não invasiva em D60 usando espectroscopia de RM in vivo de 31-fósforo (31P). Enquanto o pH da intramiofibrilares basal não diferiu entre os dois grupos (arquivo adicional 1: Fig. S2A), a extensão da acidose ao final do exercício foi menor (p = 0,016) nos animais RyR1 Rec (arquivo adicional 1: Fig. S2B), sugerindo assim que o fluxo glicolítico no exercício muscular foi reduzido nestes animais. Além disso, a constante de tempo da ressíntese de fosfocreatina pós-exercício (τPCr) foi significativamente menor (p = 0,047) em ratos RyR1-Rec (arquivo adicional 1: Fig. S2C, D), refletindo uma melhora da função mitocondrial in vivo. De fato, a síntese de PCr durante o período de recuperação pós-exercício baseia-se exclusivamente na síntese oxidativa de ATP, portanto τPCr é considerado como um índice da capacidade de fosforilação oxidativa. No geral, estes resultados indicam que a redução progressiva de RyR1 está associada a uma perda progressiva de peso e uma queda na força muscular.

As propriedades fisiológicas das fibras isoladas estão comprometidas nos ratos RyR1-Rec

A alteração da função muscular foi ainda caracterizada ao nível de uma única fibra muscular, utilizando uma combinação de tensão de célula inteira e imagens confocais . A rede do tubo T foi imageada através da coloração da membrana plasmática com di-8-anepps. Nenhuma diferença qualitativa na rede (Fig. 3a, esquerda) ou diferença quantitativa na densidade média do tubo T entre as fibras CTRL e RyR1-Rec foram observadas, além de um ligeiro mas significativo encurtamento do comprimento médio do sarcômero em repouso (Fig. 3a, gráficos à direita). O fluxo de Ca2+ ativado por voltagem através do DHPR (Fig. 3b-d) e do fluxo de liberação de Ca2+ através do RyR1 (Fig. 3e-i) foram avaliados simultaneamente. Em comparação com as fibras CTRL, as fibras RyR1-Rec apresentaram correntes de DHPR Ca2+ ativadas por tensão de curso temporal semelhante (Fig. 3b), mas com densidade reduzida, como mostra a densidade de corrente de pico versus tensão nos dois grupos (Fig. 3c), o que se traduziu numa redução de 30% na condutância máxima (Gmax), sem alteração associada dos outros parâmetros da relação corrente versus tensão (Fig. 3d). A dependência de tensão da liberação do SR Ca2+ foi avaliada a partir da imagem de varredura de linha do corante sensível a Ca2+ rhod-2. As imagens de varredura de linha das fibras RyR1-Rec foram qualitativamente similares às das fibras CTRL (Fig. 3e), mostrando um rápido aumento da fluorescência na despolarização da membrana do tubo T, espacialmente homogênea ao longo da linha varrida. A taxa de liberação do SR Ca2+ (Fig. 3g), calculada a partir das mudanças na fluorescência do rodo-2 provocadas pelos pulsos despolarizantes de amplitude crescente (Fig. 3f), exibiu um curso temporal semelhante nas fibras RyR1-Rec e nas fibras CTRL, mas, o mais importante, os valores de pico foram reduzidos no RyR1-Rec. O ajuste da taxa de pico de liberação de Ca2+ do SR em relação à tensão (Fig. 3h-top gráfico) indicou que a taxa máxima de liberação de Ca2+ foi reduzida em 25% no grupo RyR1-Rec (Fig. 3i, Max), o fator de inclinação (k) também foi ligeiramente, mas significativamente reduzido, enquanto a tensão de ativação média (V0,5) permaneceu inalterada. Um ligeiro (1,3 ms em média), mas significativo aumento na taxa de tempo de liberação do SR Ca2+ nas fibras RyR1-Rec (Fig. 3h, gráfico inferior) foi observado. Não foram observadas modificações na capacidade de remoção do Ca2+ citosólico das fibras (função de bomba SERCA), medida com o corante de baixa afinidade Ca2+-fluoro-4 FF sensível em condições não tampão-EGTA (arquivo adicional 1: Fig. S3). Em geral, estes resultados demonstram que a redução de 35% na quantidade de RyR1 no interósseo está associada a uma redução de 30% na corrente de cálcio através de DHPR e uma redução de 25% no fluxo de cálcio através de RyR1.

RyR1 redução afeta a estrutura muscular esquelética

Para entender melhor a base destas alterações funcionais associadas a uma diminuição no RyR1, a estrutura muscular foi estudada em animais RyR1-Rec em D75 após recombinação, e comparada com animais CTRL. Extensor digitorum longus (EDL), um músculo de contração rápida, sola, músculo de contração lenta e tibialis anterior (TA), um músculo misto foram analisados utilizando manchas de hematoxilina-eosina, NADH e tricromia de Gomori. As manchas de AT, apresentadas na Fig. 4a, mostram estrutura muscular anormal em animais RyR1-Rec, sem fibrose ou núcleos centrais, mas com atrofia das fibras, afetando as fibras do tipo I e tipo II (Tabela 2). Uma desorganização da mitocôndria caracterizada por acúmulo/depleção local em regiões adjacentes da mesma fibra (ponta de seta e inset Fig. 4a) e acúmulo de coloração vermelha observada com tricromio de Gomori (arquivo adicional 1: Fig. S4) também foi observado, assemelhando-se aos núcleos empoeirados recentemente descritos nos pacientes. A atrofia das fibras foi observada em ambos os tipos de fibras na EDL, embora a redução tenha sido ligeiramente mais importante nas fibras do tipo I (Tabela 2). A secção transversal da AT de ratos CTRL e RyR1-Rec foi corada com anticorpos contra RyR1 e desmin. Nenhuma modificação foi observada na distribuição de RyR1 entre as fibras tipo I e tipo II nas seções TA de RyR1-Rec, indicando uma redução semelhante de RyR1 em todos os tipos de fibras (Fig. 4b). Surpreendentemente, uma modificação importante foi observada na distribuição de desmin, com um enorme aumento nas fibras pequenas do tipo I (Fig. 4b): nos cortes TA CTRL, todas as fibras apresentaram uma coloração periférica semelhante, enquanto as fibras pequenas do tipo I nos cortes TA RyR1-Rec foram fortemente coradas tanto na periferia das fibras quanto no citosol (inset Fig. 4b). Embora a rotulagem IF não seja quantitativa, esses resultados mostram que a redução de RyR1 foi muito provavelmente homogênea, sem nenhuma diferença enorme entre fibras adjacentes, como observado para desmin, sendo a quantificação realizada pelo Western blot o reflexo da proteína contida em cada fibra e não uma média de fibras com 0% de RyR1 e fibras com 100% de RyR1 dentro do mesmo músculo.

Organização das tríades foi estudada mais detalhadamente usando a marcação imunofluorescente de fibras EDL isoladas (Fig. 5a). A etiquetagem da alfa-actinina (como marcador da linha Z), da triadina e do RyR1 (como marcadores de tríade) na fibra EDL RyR1-Rec demonstrou que a redução na quantidade de RyR1 resultou em uma desorganização generalizada da fibra com localização anormal das tríades e ruptura da linha Z, mas a triadina e o RyR1 ainda estavam parcialmente localizados. Embora as tríades tenham permanecido em ambos os lados da linha Z, a linha Z não formou uma linha reta como na CTRL e, ao invés disso, apresentou muitas micro-disrupções (inset Fig. 5a). A ultraestrutura muscular foi analisada por microscopia eletrônica nas fibras RyR1-Rec EDL em D75 (Fig. 5b). Algumas regiões apresentavam uma estrutura relativamente preservada (Fig. 5b, fibra esquerda), enquanto algumas regiões adjacentes eram altamente desorganizadas, com ruptura da organização regular do sarcômero, desorganização das mitocôndrias e presença de numerosas pilhas de membranas (Fig. 5b, setas, ampliadas no inset), anteriormente chamadas de tríades múltiplas. As características morfológicas dessas tríades múltiplas em comparação com as tríades simples normais são apresentadas na Tabela 3, e exemplos adicionais são apresentados no arquivo adicional 1: Fig. S5. A quantificação precisa da largura do tubo T, largura do SR e espaço intermembrana (tubo T/SR) (arquivo adicional 1: Fig. S5) demonstrou um enorme aumento do tamanho médio do tubo T nesses múltiplos tríades (aumento duplo, atingindo 202% do tamanho do tubo T na tríade normal), enquanto a largura média do SR foi apenas ligeiramente aumentada (+ 10%) e o espaço intermembrana não foi modificado. Esses resultados apontam para uma desorganização estrutural generalizada da musculatura dos ratos RyR1-Rec associada à remodelação das membranas.

RyR1 redução está associada a modificação na quantidade de numerosas proteínas

As consequências da redução de RyR1 foram estudadas a nível molecular usando o Western blot quantitativo sobre o músculo quadriceps de CTRL ou RyR1-Ratos Rec Rec (8 animais em cada grupo) em D75 após a injeção de tamoxifen (Fig. 6). A quantidade relativa de numerosas proteínas envolvidas direta ou indiretamente no manuseio do cálcio foi estimada, usando como referência a quantidade total de proteínas determinada pela avaliação sem manchas . Não foi observada diferença na quantificação de RyR1 entre este método e o uso da cadeia pesada de miosina como proteína de referência (comparação entre as Figs. 1, 6). Nenhuma modificação significativa entre os músculos CRTL e RyR1-Rec foi observada na quantidade da isoforma de triadina T95, a proteína de ligação de cálcio CSQ1, a proteína Ca2+-ATPase SERCA, a foF1-ATPase mitocondrial e a subunidade alfa 1 de DHPR (Fig. 6a, b). Em contraste, foi observado um aumento na quantidade de STIM1 (× 3,7 ± 1, p = 0,02), a isoforma de triadina T51 (× 1,6 ± 0,1, p < 0,001), CLIMP63 (× 1,8 ± 0,2, p = 0,004), e ORAI1 (× 3,7 ± 1, p = 0,017). Como a modificação na localização da desmin estrutural da proteína foi observada usando a marcação imunofluorescente (Fig. 5b), o nível de expressão de desmin também foi quantificado e um enorme aumento na quantidade de desmin foi observado (× 8,2 ± 1,2, p = 0,001). A localização do CLIMP63 e STIM1 nas fibras RyR1-Rec EDL foi analisada utilizando a marcação imunofluorescente, e nenhuma modificação importante foi observada (arquivo adicional 1: Fig. S6). Portanto, a redução da proteína RyR1 foi associada a um aumento nas diferentes proteínas envolvidas na regulação de cálcio ou na arquitetura muscular.

Autofagia é alterada como resultado da redução de RyR1

Alteração em autofagia tem sido observada em algumas miopatias . A fim de identificar os mecanismos que levam à atrofia muscular após a redução de RyR1, procuramos modificações no fluxo de autofagia nos músculos RyR1-Rec. A quantidade de LC3 II, uma proteína da membrana dos autofagosomas, foi avaliada com a mancha ocidental quantitativa (Fig. 7a, b), e um aumento de LC3 II foi observado (172% ± 32%, p = 0,03). Esse aumento nos autofagosomas poderia refletir tanto um aumento na formação de autofagosomas (devido a um aumento no processo de autofagia) quanto uma diminuição na sua fusão com lisossomos (e, portanto, uma inibição da degradação dos autofagosomas). A natureza precisa da modificação do fluxo de autofagia foi ainda analisada pela quantificação do p62, uma proteína bem conhecida especificamente degradada via autofagia, cuja quantidade também foi significativamente aumentada (Fig. 7a, b, 172% ± 22%, p = 0,006). O aumento associado no LC3 II e no p62 no músculo RyR1-Rec em relação ao controle sugeriu que a redução do RyR1 estava, portanto, associada à inibição do fluxo da autofagia. Além disso, um aumento na ativação (fosforilação) de dois inibidores da autofagia, mTOR e proteína S6 (Fig. 7b, c), foi observado (aumento de P-mTOR/mTOR em 174% ± 17%, p = 0,01; aumento de P-S6/S6 em 320% ± 50%, p < 0,001). O aumento da fosforilação destes dois inibidores de autofagia em animais RyR1-Rec em relação aos controles apontou ainda mais para uma inibição da autofagia responsável pela atrofia muscular em animais RyR1-Rec.

Biópsias de pacientes humanos apresentam defeitos semelhantes aos observados em ratos RyR1-Rec

Num estudo recente sobre uma grande coorte de pacientes com miopatia congênita recessiva, identificamos a presença de estruturas atípicas, chamadas “núcleos empoeirados”, em mais da metade dos pacientes com redução da quantidade de RyR1. Eles foram observados por coloração múltipla e diferem do núcleo central clássico (regiões bem definidas e desprovidas de coloração oxidativa) por suas bordas mal definidas, sua desorganização miofibrilar focal, deposição de material granular vermelho-púrpura na coloração tricromada de Gomori e área mesclada com diminuição ou/e aumento da atividade enzimática nas colorações oxidativas (arquivo adicional 1: Fig. S7). Estas alterações estruturais espelham as modificações observadas em nosso modelo de mouse (Fig. 4 e arquivo adicional 1: Fig. S7). Portanto, comparamos ainda nosso novo modelo de camundongo e biópsias musculares de pacientes com redução da proteína RyR1 e “núcleos empoeirados”. Utilizando o Western blot quantitativo, a quantidade de proteínas que foram claramente modificadas em nosso modelo de camundongo também foi estimada em 5 pacientes com uma doença recessiva do Dusty Core (duas mutações de RyR1 resultando em RyR1 redução protéica – Fig. 8a). Biópsias de controle de diferentes idades (entre 3,5 e 64 anos) foram utilizadas como referência. Uma grande redução na proteína RyR1 foi observada em todos os pacientes (nível médio de expressão 19,8% ± 2,2% de CTRL, p < 0,001). Além disso, um aumento na CLIMP63 e desmin também foi observado. A redução da RyR1 foi associada a um importante aumento da CLIMP 63 (aumento do nível de expressão médio de cinco vezes, 516% ± 220%). Além disso, o nível de expressão de desmin também foi drasticamente aumentado nos pacientes em comparação ao controle (aumento médio do nível de expressão 240 vezes, 24 170% ± 7 635%). Usando microscopia eletrônica para analisar a ultraestrutura da biópsia do paciente, muitas pilhas de membranas foram observadas nas regiões desorganizadas (Fig. 8c, setas) de todos os pacientes. Essas regiões, semelhantes às pilhas observadas no músculo RyR1-Rec (Fig. 4b), apontavam para um mecanismo comum, tanto em ratos quanto em humanos, levando à formação dessas estruturas como resultado da redução de RyR1. Com modificações idênticas às dos pacientes com Dusty Core Disease, este modelo constitui assim um modelo relevante para o estudo dos mecanismos fisiopatológicos.